解脲脲原体感染对精子血管内皮生长因子及其受体表达和精子顶体酶的影响

马晓萍 岳应权 高晓勤

遵义医药高等专科学校组织胚胎学教研室（贵州遵义563006）

解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）是一类缺乏细胞壁的原核细胞微生物，是人类泌尿生殖道感染的常见病原体，可感染睾丸、生殖管道及附属性腺中，引起精子形态、结构和功能的改变，从而导致男性不育［1］。研究报道，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）广泛表达于人的睾丸、附睾、精囊和前列腺组织，且VEGF蛋白在精液中也有高表达［2］。VEGF及其VEGFR2的特异性表达对精子的发生发育以及最终成熟都有重要影响，并对精子的受精能力也起重要作用［3］。在受精过程，精子顶体酶（acrosin）是关键酶之一［4］，对于精子顶体酶活性的检测对评估精液质量以及精子受精能力都有非常重要的临床意义［5］。本研究为探讨Uu感染对精子VEGF和VEGFR2的表达量和精子顶体内acrosin活性的影响，以阐明Uu感染引起男性不育的机制，为临床诊断Uu感染的男性不育以及药物治疗效果的评估提供有效的检测指标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂美国Pharmacia公司的Percoll分离液；美国Abcam公司的VEGF、VEGFR2抗体（兔抗人多克隆）；北京中山金桥生物技术有限公司的山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor®594标记）；美国Abcam公司的DAPI染色液；珠海迪尔公司的Uu培养鉴定试剂盒；美国Toscience公司的精子细胞BWW培养液；武汉博士德生物有限公司的RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒；AmershamBioscience公司的PVDF膜和ECL化学发光试剂。

1.2 标本来源研究对象均来自贵州医科大学第一附属医院门诊男性不育症患者，就诊时间为2015年5月至2016年10月。正常生育组（30例）：年龄22～40岁，均有生育史，按照WHO规定的精液标准进行精液常规各项检查，检查结果均符合正常精液标准。不育组（145例）：年龄23～42岁，婚后1年以上不育且已排除女方不孕因素，无性功能障碍病史、遗传性疾病家族史及外伤史，生殖系统无器质性病变，精浆及血清抗精子抗体阴性，精液细菌培养阴性，血清衣原体抗体阴性。本研究经医院伦理学委员会批准，且患者知情同意。

1.3 精液采集与分析无菌采集精液，待完全液化后，进行精液常规检查（辅助精子分析仪型号：CASASQH-Ⅲ型），检测分析精液常规各项指标（精子浓度、精子活力、精子形态等）。严格按试剂盒操作说明书进行，对精液进行Uu培养鉴定及药敏试验。

1.4 Westernblot检测精子VEGF蛋白表达 精液标本采用密度梯度法离心分离出成熟精子。收集精子并悬浮洗涤2次，调整精子浓度。分别采用RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒，进行细胞蛋白提取和蛋白浓度测定。提取50 μg蛋白经电泳分离、转PVDF膜、TBS封闭后，滴加兔抗人多克隆VEGF抗体（1∶500稀释）振荡过夜；再滴加1∶10 000稀释的HRP标记的酶标二抗，经洗膜、显影，成像扫描。用目标蛋白积分吸光度与内参蛋白吸光度的比值表示蛋白相对表达量。

1.5 免疫荧光检测精子VEGFR2蛋白表达精子涂片后室温干燥，涂片分别滴加3%H2O2和1%Triton X-100孵育再用山羊血清封闭60 min。加入1∶400稀释的兔抗人多克隆VEGFR2抗体过夜。洗涤后加入1∶100稀释的山羊抗兔IgG（Alexa Fluor®594标记）室温孵育。DAPI染色后封片。分别随机选取多个视野摄片用激光共聚焦显微镜观察并照相，每组观察200个精子计数精子VEGFR2标记阳性率。

1.6 改良明胶底物膜法检测arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）在改良明胶底物膜片滴加精子悬浮液50 μL于恒温恒湿箱孵育（37℃，3 h），在Leica DME光学显微镜下随机选取数个视野对每张孵育片进行观察，每个视野观察200个精子。arcosin反应阳性为精子头部出现明显亮环并计数arcosin阳性反应率。arcosin活性强度为每个精子头部亮环直径平均值，采用图像分析系统中测微尺测量。

1.7 统计学方法结果以均数±标准差表示。实验数据和ANOVA单因素方差分析检验采用SPSS 17.0统计软件，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的精液常规检测结果145例不育组中，精液Uu培养结果阳性47例，阳性率32.41%（47/145）。Uu阳性不育组与Uu阴性不育组精液分析结果（表1）。Uu阳性不育组的精子密度、精子活动率和精子正常形态率均明显低于正常生育组和Uu阴性不育组（P＜0.05）。

2.2 Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的精子VEGF蛋白的表达Western blot显示正常生育组和不育各组精子多数存在VEGF蛋白的表达，结果显示与正常生育组比较，Uu阳性不育组的精子VEGF/GAPDH平均光密度均明显低于Uu阴性不育组和正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

表1 Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的精子密度、精子活动率和精子正常形态率Tab.1 Sperm concentration，spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu x±s

表1 Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的精子密度、精子活动率和精子正常形态率Tab.1 Sperm concentration，spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu x±s

注：与正常生育组比较，*P＜0.05

组别正常生育组Uu阴性不育组Uu阳性不育组例数30 98 47 Uu培养阳性率［例（%）］0（0.00）0（0.00）47（32.41）精子密度（×106/mL）101.30±14.15 82.78±12.29*64.32±10.15*精子活动率（%）67.23±6.92 42.49±6.29*32.12±4.94*精子正常形态率（%）39.76±7.45 23.68±5.75*14.18±4.02*

2.3 免疫荧光检测正常生育组和不育各组的精子VEGFR2蛋白正常生育组多数精子VEGFR2荧光表达均匀而明亮；Uu阴性不育组中部分精子VEGFR2荧光表达减弱；Uu阳性不育组中多数精子顶体处VEGFR2表达不均匀，精子荧光强度减弱，精子荧光阴性增多（图2）。Uu阳性不育组的精子VEGFR2阳性率明显低于Uu阴性不育组和正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 改良明胶底物膜法检测arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）Uu阳性不育组的arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）明显低于Uu阴性不育组和正常生育组，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图1 Western blot检测VEGF蛋白在精子的表达Fig.1 Detection of VEGF protein expression by Western blot

图2 免疫荧光检测精子VEGFR2蛋白的定位Fig.2 The localization of VEGFR2 on human spermatozoa by indirect immunofluorescent

图3 改良明胶底物膜法检测arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）（光镜×400）Fig.3 The acrosin activity（acrosin-positive rate，acrosin-activity intensity）were examined by improved fixed-substrate film method.（LM ×400）

2.5 精子VEGF蛋白表达量、精子VEGFR2阳性率与arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）的相关性相关性分析提示精子VEGF蛋白表达量与arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）之间存在正相关关系（r=0.458、0.306，P＜0.01）；精子VEGFR2阳性率与arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）之间存在正相关关系（r=0.748、0.576、P＜ 0.01）。

3 讨论

男性生殖道感染是引起男性不育的一个重要病因，Uu是引起男性泌尿生殖道感染的常见病原体，常寄居于泌尿生殖道，引起非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、附睾炎等，导致男性不育［6］。精子在附睾内达到功能成熟从而获得受精能力，并依赖附睾合成和分泌的蛋白产生作用［7］。VEGF及其VEGFR2在人附睾组织中表达且与雄性生殖有关［8-9］。研究证实VEGF及其VEGFR2在附睾特异性表达不仅参与构建精子附睾内成熟的微环境，共同调节附睾微循环，还与精子在附睾中的成熟密切相关［10］。目前对Uu感染是否会影响精子VEGF及其VEGFR2表达尚未见相关报道，对于精子VEGF蛋白表达和VEGFR2阳性率是否与受精关键酶arcosin活性存在相关性，也未可知。因此，本研究通过检测精子VEGF及其VEGFR2表达和精子arcosin活性，探讨Uu感染对男性不育的影响的主要功能指标。

本实验结果证实Uu阳性不育组的精子VEGF蛋白表达量明显低于正常生育组和Uu阴性不育组，并采用免疫荧光明确VEGFR2清晰表达于人精子顶体，正常生育组多数精子顶体VEGFR2荧光表达强且阳性率较高，而精子VEGFR2表达在Uu阳性不育组的荧光表达和阳性率明显减弱。研究已表明，Uu感染时，会广泛引起睾丸病理损伤并影响生殖功能［11］，还可导致白细胞增加并产生活性氧和细胞因子损伤细胞结构［12］。而VEGF与精子顶体形成密切相关，精子细胞顶体发育的全过程都有VEGF参与，VEGF表达可能在顶体发育中起重要作用［13］。因此，笔者推测Uu感染可能会引起附睾功能紊乱，而附睾功能紊乱会造成精子VEGF蛋白表达量减少及其VEGFR2阳性率下降，导致精子成熟障碍从而引起不育患者生育能力低下。研究表明VEGFR2在精子顶体有较高表达［14］。本研究也证实人精子顶体存在VEGFR2蛋白表达，说明在精子顶体的功能成熟过程中，精子VEGF表达并与精子VEGFR2特异的结合可能起着重要作用。

Uu感染造成生殖系统中吞噬细胞增多，产生氧自由基并与细胞膜上发生过氧化反应，生成的过氧化产物可分解精子膜上的脂类，破坏精子膜的完整性［14］。而精子顶体膜结构的不完整将会造成顶体内膜上的顶体酶释放障碍［15］，使精子发生顶体反应障碍，阻碍精子穿透卵子透明带导致受精失败［16］。

本研究结果显示Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）明显低于正常生育组，且Uu阳性不育组的arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）为3组中最低，充分说明Uu感染会引起精子顶体处膜结构受损，导致顶体内容物（包括arcosin）的流失，使精子与透明带结合能力下降从而造成男性生育力的低下。

本研究首次证实精子VEGF蛋白表达量、VEGFR2阳性率分别与精子arcosin活性（arcosin阳性反应率、arcosin活性强度）呈正相关。Uu阳性不育组与Uu阴性不育组的精子VEGF蛋白表达减少和VEGFR2阳性率的降低都与精子顶体酶活性减弱密切相关。结果说明精子功能成熟的顶体完整率和顶体酶活性都较高，而Uu感染导致精子VEGF蛋白表达量及VEGFR2阳性率下降，同时会影响精子顶体成熟并引起精子顶体酶活性降低，而这些因素均可能使精子与透明带结合障碍导致男性生育能力低下。

综上所述，Uu感染可以引起附睾功能紊乱导致精子VEGF蛋白表达量及VEGFR2阳性率下降，还可以通过破坏精子膜完整性，引起精子顶体酶活性低下，从而使精子受精能力的下降导致男性不育，这也可能是Uu感染造成男性不育的重要原因之一。检测精子VEGF蛋白及VEGFR2的表达和顶体酶活性为男性不育症的诊断和药物治疗提供重要的基础理论依据。