结核性胸膜炎患者MAIT细胞Granzyme B免疫应答特征及其与疾病转归的相关性

曹志红 蒋静 俞珊 杨秉芬 刘艳华 安红娟 王若 翟斐 程小星

解放军总医院第八医学中心全军结核病研究所，1全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室，2结核四科（北京100091）

结核病（tuberculosis，TB）是传染性疾病中第二位最常见的致死性原因［1］。据估计，2013年新发900万例结核病，有150万人死于结核病［2］。尽管人类结核分枝杆菌感染率很高，特别是在发展中国家，但只有5%～10%的感染者在其一生中有可能发展为活动性结核病［3-4］。结核分枝杆菌与宿主之间的相互作用在很大程度上决定了结核感染的发展和结果［3，5-7］。结核分枝杆菌主要感染肺部，但也会感染其它器官而引起肺外结核，结核性胸膜炎是最常见的肺外结核之一。黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT cell）是一类表达恒定T细胞受体（TCR）α链的天然免疫样T细胞，属于进化保守的T细胞，主要分布于外周血、肠道固有层淋巴组织、肝脏和肺脏中［8-10］，受进化上保守的主要组织相容性复合物（MHC）样分子MR1的限制。MAIT细胞可能通过生成细胞因子和细胞毒性效应分子如IFN-γ、TNF-α、IL-17和Granzyme B等在人体抵御细菌和真菌感染过程中发挥重要作用，同时还参与多种炎症性疾病的发病过程［11］。笔者对结核性胸膜炎患者胸腔积液中MAIT细胞对结核抗原免疫应答生成的Granzyme B（Granzyme B+MAIT）情况及其与疾病转归的相关性进行分析，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年7-11月期间入住本院结核病研究所的25例首次入院结核性胸膜炎患者的胸水进行分析，其中有10例在治疗1～2周后重复收集胸水，分析CD8+T细胞亚群中Granzyme B+MAIT比例。本研究获得医院伦理委员会的批准。

1.2 诊断标准按照2000年中华医学会结核分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》，所有结核病患者均进行胸部X线检查，根据症状、分枝杆菌涂片及培养、PCR、病理检查、T.SPOT-TB检测结果和治疗情况综合确诊，排除使用激素或其它影响免疫功能的疾病如HIV感染、移植术后、自身免疫病等。

1.3 试剂Ficoll密度梯度淋巴细胞分离液购自GE公司（USA），RPMI 1640培养液和AIM-V无血清培养液购自GIBCO公司（USA），胎牛血清（FBS）购自四季青公司，PBS购自索莱宝公司。LEAF纯化的抗人CD28单克隆抗体（克隆CD28.2）、TCR Vα7.2-FITC（Cat号：351704）和 CD161-PE-cy7（339918）单克隆抗体及各自Isotype对照抗体购自Biolegend公司，CD3-ECD单克隆抗体（A07748）购自Beckman Coulter公司，CD8-PE-cy5单克隆抗体（555368）和Granzyme B-PE（561142）单克隆抗体及其Isotype对照抗体购自美国BD公司。Golgi plug、固定/破膜试剂盒购自美国BD公司。

1.4 方法

1.4.1 人胸水单个核细胞（PFMCs）的分离收集胸水，1 h内进行分离，室温1 800 r/min×5 min离心。弃上清，加入RPMI 1640培养液重悬，室温1 900 r/min×7 min离心。弃上清，加入5 mL RPMI 1640培养液重悬。然后进行Ficoll密度梯度离心（室温1 000 g，20 min）获取 PFMCs，获取的 PFMCs经RPMI 1640培养液充分洗涤2次后，用AIM-V无血清培养基调整细胞密度为5×106/mL，加入96孔细胞培养板，每孔约1×106个PFMCs细胞（体积200 μL）。

1.4.2 PFMCs细胞的培养及抗原刺激每孔细胞悬液中加入结核分枝杆菌H37Rv裂解液（终浓度20 μg/mL），共刺激抗体CD28 200 ng。在5%CO2、37℃孵箱中孵育16～18 h，然后加入Golgi plug 0.2 μL，4～ 6 h后细胞内因子染色。

1.4.3 荧光抗体染色取培养后细胞用含2%FBS的PBS洗涤（300 g，5 min），吸去上清。20 μl 2%FBS-PBS重悬混匀后，按抗体说明量分别加入CD3-ECD、CD8-PE-cy5、TCR Vα7.2-FITC和CD161-PE-cy7单克隆抗体，4℃避光染色30 min。再用含2%FBS的PBS洗涤（300 g，5 min）1次。加入250 μL固定破膜剂，4℃固定20 min；然后用1×破膜缓冲液洗涤一次（900 g，5 min），然后加入Granzyme B-PE单克隆抗体，4℃避光染色30 min，用1×破膜缓冲液洗涤一次，弃上清后重悬于300 μL 2%FBS-PBS中，4℃避光保存。同时采用各荧光标记的同型对照，作为染色的背景水平。

1.4.4 流式细胞分析荧光抗体染色后，用流式细胞仪（Beckman coulter FC500）分析，获取细胞数不少于100 000个。分析MAIT细胞中Granzyme B的表达，然后采用Beckman CXP软件进行分析。

1.5 统计学方法本文数据用（）表示，采用GraphPad Prism5软件比较，两组之间比较进行非参数Mann-Whitney检验，治疗前后比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者人口统计学特征本试验共收集到25份胸水，全部都是新发结核病患者，其中男性18例，女性7例。年龄（35.32±2.64）岁。

2.2 MAIT细胞对结核抗原应答生成的Gran⁃zymeB比例 从流式FSC/SSC散点图中圈出淋巴细胞，然后选取CD3+CD8+群细胞设门，再选择Vα 7.2+CD161high细胞作为MAIT细胞，分析Granzyme B的表达（图1A）。经结核分枝杆菌H37Rv裂解液抗原刺激后，结核性胸膜炎患者胸腔积液中GB+MAIT细胞比例为（25.34±5.37）%（图1B）。

2.3 GranzymeB+MAIT细胞比例分组比较

2.3.1 年龄绘制Granzyme B+MAIT细胞比例与年龄的散点图，发现没有明确的相关性（图2A）。将患者按年龄分成≤40岁和＞40岁两组，各组Granzyme B+MAIT细胞比例分别为（24.58±5.46）%和（26.96±12.82）%，经Mann Whitney检验差异无统计学意义（U=56.5，P=0.521 5）（图2B）。

2.3.2 性别男性和女性患者胸水中Granzyme B+MAIT细胞比例分别为（25.02±6.29）%和（26.16±11.13）%，经Mann Whitney检验差异无统计学意义（U=61.50，P=0.951 7，图2C）。

图1 Granzyme B+MAIT细胞比例Fig.1 Granzyme B+MAIT cell ratio

2.4 治疗前后结核性胸腔积液中GranzymeB+MAIT细胞的变化 有10例在治疗1～2周后重复收集胸水，其中7例治疗效果好，Granzyme B+MAIT细胞比例明显上升（图3A、3B），治疗前后比例分别为（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，采用配对t检验，差异有统计学意义（t=9.867，P＜0.000 1，图3C）。3例治疗效果不好的患者Granzyme B+MAIT细胞比例明显低于治疗效果好的患者，且治疗后比例上升不明显，治疗前后比例分别为（4.23±0.54）%和（6.60±0.61）%，差异没有统计学意义（t=2.064，P=0.175 0，图3D）。

3 讨论

PORCELLI等［12］首先在肠黏膜淋巴组织中发现并提出了MAIT细胞这一概念。人MAIT细胞在外周血T细胞中占1%～10%，其T细胞受体（TCR）由一条半恒定的Vα7.2链组成，与有限数量的TCR β链配对。人MAIT细胞可以通过Vα7.2和CD161阳性表达来识别［13-14］。与传统的CD4和CD8 T细胞与肽抗原发生反应和CD1限制性T细胞识别含脂质的抗原不同，MAIT细胞代表了一类新的T细胞，它们可以识别由主要组织相容性复合物（MHC）样分子MR1提呈的微生物合成的维生素B代谢物而受到激活［15-18］。目前对MAIT细胞抗感染免疫方面的研究主要集中在外周血中，对感染局部作用的研究较少。

图2 Granzyme B+MAIT细胞比例分组比较Fig.2 Granzyme B+MAIT cell ratio comparison between groups

图3 治疗前后Granzyme B+MAIT细胞比例比较Fig.3 Comparison of the proportion of Granzyme B+MAIT cells before and after treatment

MAIT细胞在抗微生物感染中通过生成效应分子而发挥重要功能，如IFN-γ，肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-17。MAIT细胞在宿主抗分枝杆菌感染免疫中的功能主要在动物模型中进行研究，发现MAIT细胞通过产生IFN-γ能有效抑制巨噬细胞中牛分枝杆菌BCG的生长［19］。在小鼠分枝杆菌肺部感染中，MAIT细胞聚集至肺部，提供早期保护性免疫［20］。在人体中，活动性结核病患者外周血中MAIT细胞比例下降，但是在肺部和结核性腹膜炎患者的腹水中含量较高［21-22］，说明MAIT细胞能在感染部位明显富集，而且结核性胸腔积液中MAIT细胞对结核分枝杆菌抗原的免疫应答高于外周血［23］。提示MAIT细胞可能参与局部抗菌免疫，但是MAIT细胞如何发挥抗菌活性仍然不得而知。虽然已经确定动物感染模型中MAIT细胞在对宿主分枝杆菌感染防御中起重要作用，但MAIT细胞在结核患者中的功能作用仍然很大程度上未知。颗粒酶B（Granzyme B）是一种丝氨酸蛋白酶，最常见于细胞毒性淋巴细胞（CTL）、天然杀伤细胞（NK细胞）和细胞毒性T细胞的颗粒中。它由这些细胞与穿孔素一起分泌，以介导靶细胞的细胞凋亡。有研究发现，MAIT细胞在未刺激情况下表现为静息记忆表型，刺激后，通过上调效应分子特别是Granzyme B的表达来发挥细胞溶解等效应功能，进而在传染病和癌症中发挥功能［24］。

在这项研究中，笔者调查了结核性胸膜炎患者胸腔积液中MAIT细胞的免疫应答特征，经结核分枝杆菌抗原刺激后，结核性胸膜炎患者胸腔积液中Granzyme B+MAIT比例为（25.34±5.37）%。男女性和不同年龄患者的Granzyme B+MAIT细胞比例均无显著差异。7例治疗效果好的患者治疗后Granzyme B+MAIT细胞比例明显上升，治疗前后比例分别为（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，差异有统计学意义（t=9.867，P＜0.000 1）。3例治疗效果不好的患者Granzyme B+MAIT细胞比例明显低于治疗效果好的患者，且治疗后比例上升不明显。

本研究发现结核性胸腔积液中MAIT细胞对结核抗原发生免疫应答而生成Granzyme B，而且治疗有效时Granzyme B量明显升高，说明MAIT细胞可能通过颗粒酶B的细胞毒性杀伤作用而在局部抗结核免疫中发挥重要作用。