FOXL2基因对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

曲春安 张伟 尹迪迪 李东岳 李敏 王晓雨 张欣 唐胜建

潍坊医学院整形外科研究所（山东潍坊261000）

FOXL2是由单一外显子编码的一个叉头型转录因子，属于叉头框转录因子超家族中的一员，与小睑裂综合征（blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome，BPES）、卵巢早衰有关，并参与性别决定。此外，FOXL2在多种肿瘤组织之中也有表达，已被发现的与该基因有关的肿瘤包括结直肠癌、卵巢颗粒细胞瘤、乳腺癌、性索间质细胞的肿瘤等。目前，癌症问题已成为了全球热点问题，尤其是相关基因，如癌基因、抑癌基因等研究越来越得到重视。基因层面的研究有望成为治疗及预防癌症的重要手段，基因的靶向治疗研究已成为热点。例如，在97%的成人卵巢颗粒细胞肿瘤中均发现了FOXL2基因的突变（402C突变为G），并且该突变基因具有较高特异性［1-2］。另外，在结直肠癌中也发现了FOXL2位点的失活，是体细胞超甲基化所导致的［3-4］。2011年WEGMAN等［5］率先发现在乳腺癌中也有FOXL2基因的表达，并证明可能与芳香化酶的表达及临床预后相关。WANG等［6］通过研究表明，miR-30a为乳腺癌、小细胞肺癌及结肠癌的肿瘤抑制因子，而FOXL2基因正是miR-30a的靶向基因，FOXL2基因可以促进miR-30a的表达，而miR-30a又可以通过上调BCL2A1、IER3及cyclin D2来抑制FOXL2基因的表达，从而实行相互调控［6-7］，由此也说明FOXL2与乳腺癌有关［8-10］。因此，笔者分析并探讨了FOXL2在乳腺癌细胞系中的表达及FOXL2对乳腺癌细胞生长状况的研究，进而研究BPES相关基因FOXL2与乳腺癌的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌上皮细胞MCF-7均购自中国科学院干细胞库；胎牛血清FBS和1640培养液（Gibco公司）；MEM和Trizol（上海拜力生物科技有限公司）；胰蛋白酶（BBI公司）；兔抗人FOXL2抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB显色液试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RT-PCR试剂盒及相关实验试剂（日本Takara公司）；DNA Marker（TIANGEN公司）；RIPA裂解液（普利莱基因技术有限公司）；BCA蛋白试剂盒（Thermo公司）；FOXL2-pEGFP质粒、FOXL2-shRNA质粒（上海吉凯基因科技有限公司）。

1.2 细胞培养HBL-100细胞置于RPMI-1640培养液之中培养，MCF-7细胞培养液中含有87%的MEM、10%FBS、1%双抗（中国科学院细胞库）、1%谷氨酸、1%非必须氨基酸以及人重组胰岛素，均置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养，当细胞生长密度约90%时应用0.05%Trypsin-EDTA消化传代1次。因HBL-100细胞染色体组型在第7代时就不正常，故本试验选取传代次数＜7次且处于指数生长期的HBL-100及MCF-7细胞进行后续试验。

1.3 HBL⁃100和MCF⁃7细胞中FOXL2mRNA的检测 采用荧光定量RT-PCR法。首先，分别取HBL-100和MCF-7细胞中依次加入Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC水，提取两组细胞的总RNA。紫外分光光度计测总RNAOD260/280=1.8～2.0时即为目的RNA。Primer5.0设计引物：GAPDH（230 bp）：sense：5′-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3′，Anti-sense：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3′；FOXL2（126 bp）：sense：5-TCACGCTGTCCGGCATCTACCA-3′，Anti-sense：5′-GCGGCACCTTGATGAAGCACTC-3′。应用 PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser按说明书进行逆转录反应。再应用SYBR Green Mix在Eppendorf实时荧光定量PCR仪上进行扩增及荧光检测，按说明书操作，配置反应体系为25 μL，以GAPDH为内参，反应结束后得到相应的Ct值，进行溶解曲线及扩增曲线分析。统计计算两组FOXL2 mRNA相对表达量差异有无统计学意义。

1.4 过表达及沉默FOXL2的MCF⁃7细胞中FOXL2蛋白的检测采用Western blot方法检测过表达及沉默FOXL2的MCF-7细胞模型是否成功建立。在细胞生长达90%时，加入胰酶消化后接种于6孔板中，每孔2 mL。置于恒温培养箱中培养24 h后，进行Lip2000转染实验。

1.4.1 质粒转染（1）分别将5 μg的FOXL2-pEGFP质粒和5 μg的FOXL2-shRNA质粒溶解于250 μL的无血清培养基中，标记为A、B两管。（2）取C、D两管分别加入等量的10 μL的Lip2000溶解于250 μL的无血清培养基中，室温静置5 min。（3）分别将A、B两管混合标记为E，C、D两管混合标记为F，室温静置20 min。（4）20 min后分别将E、F加入至含有1 mL培养液的MCF-7细胞中。（5）转染4～6 h后观察细胞生长密度为90%～95%时，将无血清的培养液换成含10%FBS的培养液，置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养。

1.4.2 Westernblot检测两组MCF⁃7细胞中FOXL2蛋白的表达水平 转染后48 h分别用Western blot方法检测E、F两组MCF-7细胞中FOXL2蛋白的表达水平。用携带FOXL2的过表达及沉默的质粒瞬时转染，使其过表达FOXL2（A组）及沉默FOXL2（B组）以及未作处理的对照组（C组），分别取3组MCF-7细胞依次加入裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定3组蛋白浓度，取适量蛋白产物中加入Loading Buffer，置入沸水中加热至变性，进行蛋白质SDS-PAGE电泳，将电泳后所得到的蛋白转移至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，按一抗与封闭液1∶400比例稀释FOXL2一抗，4℃孵育过夜，TBST洗掉一抗3次，每次10 min，再按二抗与封闭液1∶10 000比例稀释FOXL2二抗，室温孵育1 h，TBST洗去二抗3次，每次15 min，最后在暗室中用ECL化学发光试剂盒进行发光、显影和定影，胶片用清水冲洗后晾干，获得实验结果。采用Image-Pro Plus软件对此实验结果进行灰度值分析，目的蛋白的灰度值=目的蛋白的累积光密度值（integrated optic density，IOD）/内参的 IOD值。本实验以GAPDH作为内参。

1.5 MTT法测细胞增殖情况取指数生长的MCF-7细胞按3×103个细胞/孔分别接种于96孔板，置于恒温培养箱中培养24 h后，分别用携带FOXL2的过表达及沉默的质粒瞬时转染，使其过表达FOXL2（A组）及沉默FOXL2（B组）以及未作处理的对照组（C组），每组分别于转染后连续7 d，检测3组细胞的增殖情况。在酶标仪上490 nm处记录每孔的OD值。以培养时间作为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制细胞增殖的曲线，并计算细胞的增殖率。细胞增殖率＝实验组A组及B组的OD值/C组的OD值。实验重复3次。

1.6 统计学方法采用SPSS统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较选用SNK检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT⁃PCR法检测两组细胞的FOXL2mRNA的表达水平

2.1.1 cDNAPCR及电泳结果 成功提取到HBL-100和MCF-7细胞的总RNA，经紫外分光光度计测得两组细胞的OD值，HBL-100细胞的OD值为1.96，MCF-7细胞的OD值为1.91，其值均在1.8～2.0之间，说明RNA纯度良好。引物设计GAPDH片段长度为230 bp，FOXL2片段长度为126 bp。通过对比marker条带，凝胶成像结果清楚地显示了GAPDH和FOXL2两条条带，证明在两组细胞中均检测到了FOXL2基因的表达，且FOXL2在MCF-7细胞比HBL-100细胞中条带更亮，说明FOXL2在MCF-7细胞中表达量更高（图1）。逆转录PCR结果虽然显示了FOXL2基因在两种细胞中均表达，但只能大致显示出FOXL2在两种细胞中的表达，故笔者通过实时荧光定量PCR来检测FOXL2基因在两种细胞中的表达情况。

图1 两组细胞总mRNA 1%琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Results of total mRNA 1%agarose gel electrophoresis in two groups of cells

2.1.2 实时荧光定量PCR检测FOXL2基因和内参基因内参基因及目的基因的荧光定量PCR扩增曲线良好，溶解曲线均为单峰，说明无引物二聚体出现。2-ΔΔCt法计算两组 FOXL2 mRNA 的相对表达量，2-ΔΔCt值=2.175，证明FOXL2在MCF-7细胞中表现为上调，且差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。这表明，一方面，FOXL2基因在HBL-100和MCF-7细胞中均是表达的；另一方面，相比乳腺正常细胞，MCF-7细胞可能通过某种机制促进FOXL2基因的表达。

表1 HBL-100和MCF-7细胞定量曲线值Tab.1 Quantitative curve values of HBL-100 and MCF-7 cells

2.2 WesternBlot检测FOXL2蛋白 成功转染MCF-7细胞后，Western blot结果与C组相比，A组细胞中FOXL2蛋白表达量较C组增加了34.6%，B组细胞中FOXL2蛋白表达量较C组下降了40.4%，差异均有统计学意义（P＜0.05，图2），可见模型构建成功。

图2 Western Blot法检测FOXL2转染MCF-7后FOXL2蛋白的相对表达量Fig.2 Detection of relative expression of FOXL2 protein in MCF-7 transfected with FOXL2 by Western Blot

2.3 MTT法检测细胞增殖MTT法检测3组MCF-7细胞转染FOXL2后连续7 d的OD值，如图3所示，计算其细胞增殖率，经统计分析，A组FOXL2基因过表达，MCF-7细胞的增殖能力明显被抑制，而B组的细胞增殖能力增加，从第3天起差异有统计学意义，A组和B组的增殖率分别为12%和43%，且第5天起的增殖活力差异最明显，两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图3 MTT法检测3组MCF-7细胞转染后细胞的增殖情况Fig.3 Detection of the proliferation of MCF-7 cells in three groups after transfection by MTT assay

3 讨论

迄今为止，围绕FOXL2基因所展开的研究仍然是相关领域的一大热点，包括遗传学、眼科、妇产科、肿瘤等，在性别分化、卵巢颗粒细胞的分化、卵巢及颅面部的发育及功能维持等方面发挥着不可替代的作用。该基因最早是由CRISPONI等［11］在BPES患者体内发现并克隆定位的。BPES是一种常染色体的显性遗传病，主要表现为睑裂狭小、反向内眦赘皮、上睑下垂及内眦远距等症状，部分患者还伴有鼻梁低平、眦距增宽、发育迟缓、智力低下、小头和耳畸形等［12-15］。在过去的30年内，潍坊医学院整形外科研究所收集并随访了近67个家系共312例BPES患者的临床资料，并发现了6个新的基因突变，其Genebank ID分别为：DQ089670、DQ089671、DQ089672、bankit1169075、FJ598615、FJ589614，并已注册；另外在32%～40%的BPES患者体内并未检测到FOXL2基因的突变。

乳腺癌作为全球女性病死率最高的恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，化疗仍是目前临床上治疗乳腺癌的主要方法，但患者对化疗的反应不一，因此，如何有效地预测患者的化疗疗效及不良反应是合理使用化疗药物治疗乳腺癌的关键。十几年来，研究导致乳腺癌的发病机制及发生发展的关键因素及其通路一直是热点。FOXL2基因通过调控下游 Inhibin、CYP19A、SOX9、Grip1、BSTAR等基因的表达，参与雌激素的合成，进而决定性别等［16］。如芳香化酶为类固醇激素合成途径的关键酶，负责将雄激素转化为雌激素［17-18］。2011年WEGMAN等［5］发现在乳腺癌中也有FOXL2基因的表达，证明可能与芳香化酶的表达及临床预后相关。因此，对于小睑裂相关基因FOXL2与乳腺癌之间关系的研究显得尤为重要。

通过本次实验，笔者利用RT-PCR技术再次验证了FOXL2在乳腺癌细胞及乳腺正常细胞中的表达水平，并发现FOXL2在乳腺癌细胞中的表达水平更高；笔者的实验结果提示，FOXL2可能在乳腺癌的发生和发展中发挥着一定的生物学作用，因此笔者构建了过表达及沉默FOXL2的MCF-7细胞模型进行后续的研究；通过Western Blot实验，验证了模型的构建，最后，MTT法检测乳腺癌细胞的增殖水平，结果为过表达FOXL2基因的MCF-7细胞的增殖能力明显被抑制，而沉默FOXL2基因的MCF-7细胞的增殖能力增加，证明该基因对于乳腺癌细胞有明显的生物学作用，抑制了乳腺癌细胞的增殖，很有可能会成为一种新的抑癌基因或者是其他相关因子，可能为乳腺癌的综合治疗提供一种新的作用靶点，但具体的调控机制有待于大量的后续实验的研究。因此，仍需要对该基因的转录及翻译的调控机制进行研究，把FOXL2基因纳入到人体总调控的整体网络上，进一步研究其承上启下的功能，进而为乳腺癌的预防及治疗提供新的思路。

综上所述，FOXL2基因在乳腺细胞及乳腺癌中均转录mRNA，但仅在乳腺癌细胞之中高表达。一方面，FOXL2可以抑制乳腺癌细胞的增殖，这个生物学作用可能主要是与芳香化酶的表达有关；另一方面，FOXL2可能是一个新的肿瘤抑制因子，对乳腺癌的转移及复发有一定的价值，但仍需要做进一步的研究。