慢性髓细胞白血病不同临床缓解状态下的T细胞亚群特点研究

代景莹，邹孟颖，杨 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黄晓兵，王晓冬

(四川省医学科学院·四川省人民医院血液内科，四川 成都 610072)

慢性髓细胞白血病(CML)在酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)时代其疗效已得到了革命性的提高[1～3]。但目前仍有一部分患者不可避免地发生疾病进展[4，5]，是否可以从免疫学的角度，通过可行的相关免疫指标对患者的抗肿瘤免疫力进行监测及评估，从而指导疗效预测并及时调整治疗方案以减少疾病进展，这是一个需要进一步研究的有前景的方向。本研究对CML患者进行了T细胞亚群免疫指标的检测，以期探讨T细胞亚群中各指标的特点是否可对CML患者临床缓解程度、疗效预测起到一定指导意义。

1 资料与方法

1.1一般资料2002年9月30日至2018年9月30日我院血液内科就诊并确诊为CML慢性期的104例患者，均经骨髓细胞形态学、细胞遗传学、及分子生物学检查确诊，符合国内统一的诊断与分期标准。

1.2T细胞亚群的检测采集患者外周血进行流式细胞学检测T细胞亚群，包括CD8+T细胞比例(CD8+T/Lymphocyte)，CD4+T细胞亚群Th1细胞比例(Th1/ CD4+T)，Th2细胞比例(Th2/CD4+T)，Treg细胞比例(Treg/CD4+T)等。采用BD FACSCanto II流式细胞仪进行检测，所需免疫荧光抗体-荧光素标记的抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、 IFN-γ、IL-4抗体均购自BD公司、荧光素标记的抗Foxp3抗体购自eBioscience公司。染色过程：①Th1比例和Th2比例：全血+1640混匀，然后加入刺激剂(包括布雷非德菌素A，佛波酯，离子霉素)在孵箱培养4 h；取出后，加入相应标记的抗体，如抗CD3抗体，抗CD8抗体，混匀，室温孵育20 min；加入10X红细胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震荡，室温10 min，PBS液洗后，加入相应的固定剂，孵育30 min，PBS洗2遍，各加入IFN-γ抗体和IL-4抗体，孵育20 min；PBS洗1遍，加入适量 PBS重悬待上机检测。备注：Th细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA刺激4小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以本研究、亦是通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞，即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。②Treg比例：全血+1640混匀，然后加入相应标记的抗体，如抗CD3抗体，抗CD4抗体，抗CD25抗体，混匀，室温孵育20 min；加入10X红细胞裂解液，震荡，室温10 min，PBS液洗后加入相应的固定剂，孵育30 min，PBS洗2遍，加入Foxp3抗体，孵育20 min；PBS洗1遍，加适量PBS液重悬待上机检测。③CD8+T比例：红细胞裂解液裂红处理15～20 分钟，离心，加入相应荧光标记的抗CD45抗体、抗CD3抗体、抗CD8抗体避光4 ℃孵育20 分钟，PBS液洗后离心，重悬于适量PBS液待上机检测。其后进行上机检测。数据分析采用Diva 流式数据分析软件进行。

1.3评价标准治疗反应定义及疗效评估标准参照2013版中国慢性髓系白血病诊断与治疗指南。完全细胞遗传学缓解(CCyR)定义为Ph+细胞为0。主要分子学缓解(MMR)定义为BCR-ABLIS≤0.1%。主要分子学缓解4.5(MR4.5)定义为BCR-ABLIS≤0.0032%。Th1/CD4+T比例引用海斯特检验机构的正常参考范围11.8%～25.8%。

1.4统计学方法采用SPSS 13.0软件处理数据。计量资料比较采用方差分析及LSD法。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1患者临床特征将104例患者按照临床疾病缓解状态分为未缓解组(未达到CCyR，包括血液学未缓解及血液学缓解但未达到CCyR)(n=24)，CCyR组(n=13)，MR4.5组(n=67)，临床疾病缓解状态评估均按照患者进行T细胞亚群检测当日的临床状态进行评估。未缓解组2例伴附加染色体异常，其余102例均不伴随附加染色体异常。104例患者中，男性占64.42%，女性占35.58%。中位年龄45岁(16～78岁)，发病年龄主要集中在33～56岁。未缓解组男性占75%，女性占25%，中位年龄32.5岁(16～75岁)；CCyR组男性占76.92%，女性占23.08%，中位年龄64岁(25～70岁)；MR4.5组男性占58.21%，女性占41.79%，中位年龄46岁(17～78岁)。

2.23组四种T细胞亚群情况62.50%的未缓解组患者、15.38%的CCyR组患者及15.15%的MR4.5组患者表现出Th1比例(Th1/CD4+T)低于正常参考范围。未缓解组Th1降低率高于CCyR组和MR4.5组，Th1比例值低于CCyR组和MR4.5组(P< 0.05)，CCyR组与MR4.5组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。三组Treg比例(Treg/CD4+T)、Th2比例(Th2/CD4+T)、CD8+T比例(CD8+T/Lymphocyte)比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表1。

表1 3组四种T细胞亚群情况比较 (%)

*与CCyR组和MR4.5组比较，P< 0.05

3 讨论

随着对肿瘤免疫的认识逐渐深入，对肿瘤患者免疫状态的监测显得越来越重要，其对于疗效预测及预后评估有着重要意义。慢性粒细胞白血病在TKI时代其疗效已得到显著改善，但仍有一部分患者不可避免地出现耐药、疗效不佳，以及发生疾病进展。对CML患者免疫状态的监测与评估，对于治疗方案的指导、疗效的预测以及预后的评估可能起着重要指导意义。但以什么免疫指标作为理想的监测指标，以有效评估免疫状况及指导诊疗目前尚无统一定论，仍需进一步研究、探讨。而T细胞为抗肿瘤免疫中重要的免疫细胞，目前认为细胞免疫应答模式为主要的抗肿瘤免疫应答模式，而其中CD8+T细胞及CD4+T细胞亚群中的Th1细胞为主导细胞免疫应答的T细胞亚群[6]。由此，对CD8+T细胞及Th1细胞的监测对评估CML患者体内的抗肿瘤免疫力可能有着重要指导意义。而CD4+T细胞作为主导体内免疫应答类型的转化方向的重要辅助性T细胞，其还包括了主导体液免疫应答模式的Th2亚群，主导炎症反应的Th17亚群，以及主导免疫应答的负向调控的Treg亚群[7]，而Treg细胞在体内的水平一定程度上可反映体内免疫应答受抑制的程度[8]，Th2等其它亚群在体内的水平可从一定角度上反映体内细胞免疫应答的模式是否为主导地位。由此本中心着眼于CD8+T细胞及CD4+T细胞亚群的监测，以期其可有助于对CML患者体内的抗肿瘤免疫力进行评估，并可进一步指导临床治疗、疗效预测、与预后评估。

本研究结果显示，62.50%的未缓解组患者Th1比例值低于正常下限，而只有15.38%的CCyR组患者及15.15%的MR4.5组患者表现出Th1比例值低于正常下限，而未缓解组Th1实际平均值亦低于CCyR组及MR4.5组。Th1水平的降低，可导致体内抗肿瘤细胞免疫应答的降低，此可进一步导致肿瘤负荷的增涨与临床缓解状态的不理想。而Th1水平的升高，可促进体内抗肿瘤细胞免疫应答的活化，而其中的效应性CD8+T细胞可进一步执行有效识别、杀伤肿瘤细胞的任务，从而可进一步导致肿瘤负荷的降低与良好的临床缓解状态(CCyR或MR4.5)。本研究结果提示，Th1有潜力成为一有意义的免疫监测指标以对疗效预测起到一定指导意义。目前国内外对于CML患者Th1水平的相关研究尚较少，但已有研究报道，新诊断CML患者及慢性期CML患者的Th1水平显著低于健康对照组，提示Th1为一潜在的治疗靶点以及能为治疗带来更好的疗效获益，这在研究结论上与本研究一定程度上呈一致[9]。

除此之外，本研究亦对各组的Treg水平、Th2水平及CD8+T细胞水平进行了分析，发现上述3种T细胞亚群在未缓解组、CCyR组与MR4.5组中差异均无统计学意义。Treg一定程度上反映了体内免疫应答受抑制的程度，由本研究结果可见，在三组不同临床缓解状态的所致因素中，Treg水平可能并非起主导作用的因素。而Th2细胞为体内主导体液免疫应答模式的辅助性T细胞亚群，目前认为抗肿瘤免疫主要由细胞免疫应答模式介导，本研究结果提示三组患者中Th2细胞介导的体液免疫应答模式并非起主导地位，在导致三组不同临床缓解状态的所致因素中，Th2水平亦非起主导作用的因素。CD8+T细胞为执行细胞免疫应答的效应性T细胞，Th1水平的升高会促进CD8+T细胞的活化增殖。本研究中，三组间未观察到CD8+T比例(CD8+T/Lym)的显著差异，原因可能有以下几方面：①本研究中对CD8+T细胞的检测采用流式细胞学检测CD8+T细胞数目占淋巴细胞数目的比例，而Th1为淋巴细胞的一部分，由于Th1水平显著上升，由此上升的CD8+T在CD8+T/Lymphocyte比例上的变化表现得不显著。②CD8+T细胞总数作为检测指标不能全面地反映抗CML特异性T细胞的水平。三组不同缓解状态下的患者体内是否存在抗CML特异性CD8+T水平的差异，而导致临床缓解状态的不同，本研究中并未进行深入、具体的研究。抗CML特异性CD8+T细胞的检测原理及方法较复杂，并需要较高的成本，由此在作为对CML患者长期监测的免疫指标角度上考虑，抗CML特异性CD8+T细胞是否为一理想免疫监测指标尚难以确定。

综上，本研究结果提示，不同临床缓解状态下的CML患者T细胞亚群特点中，Th1水平为一有显著性意义的指标，Th1水平与临床缓解状态呈现正相关关系。Th1水平有望成为一长期监测的理想免疫指标，从一定角度上协助评估患者的抗肿瘤免疫力，同时可在CML患者的疗效预测上起到一定指导意义，并可对缓解状态不理想的患者及时指导调整治疗方案以减少疾病进展。