免疫细胞亚群与多发性骨髓瘤临床预后因子相关性研究

魏文波，杜 宇

(乐山市武警四川总队医院检验科，四川 乐山 614000)

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞肿瘤，细胞癌变起源于骨髓中的浆细胞。由于淋巴细胞出现免疫功能异常，致使细胞监视功能缺陷，免疫系统对于恶变的肿瘤细胞进行清除的能力下降，从而发生并发展为MM[1]。MM患者的免疫系统存在复杂的缺陷，包含DC、NK细胞、B细胞、T细胞等多个方面，这些方面可能共同参与了恶变的肿瘤细胞的免疫逃逸机制[2，3]。MM患者的生存期差异较大，寻找肿瘤临床预后因素的工作难度较大。MM常并发高钙血症、肾脏损害及贫血等，由于患者正常免疫球蛋白的生成受到抑制，容易出现细菌性感染[4]。本研究探讨免疫功能缺陷与MM危险分层以及临床预后因素的关系，为进一步研究MM的发病机制以及免疫治疗方案提供参考。

1 资料及方法

1.1一般资料2016年4月到2018年3月我院收治的32例MM患者，年龄46～77岁[(53.14±5.48)岁]，患者均为初诊；采用国际分期系统(DS)进行疾病分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，行淋巴细胞表型分析后发现患者未出现活动性感染。化疗后患者病情有24例处于稳定期，8例进展期，将患者按照年龄分组，45～60岁18例为一组，61岁以上14例为二组。32例患者与104例健康献血者进行对比，一组62例，二组42例。

1.2诊断标准[5]①患者骨髓中浆细胞增多数量>30%；②骨髓浆细胞异常增生10%～30%，活检证实为浆细胞肿瘤；③M蛋白过度产生，尿本周蛋白成分>1 g/24 h；血清IgA>20 g/L，IgG>35 g/L；④正常免疫球蛋白减少，IgA<1 g/L，IgG<6 g/L，IgM<0.5 g/L。

1.3分期标准[6]①Ⅰ期患者骨髓瘤细胞总数<0.6×1012/m2，血钙正常，骨骼X射线结果正常，或者呈现孤立性溶骨病变，血红蛋白>100 g/L，M蛋白IgA<30 g/L 、IgG<30 g/L；②Ⅱ期患者骨髓瘤细胞总数<(0.6～1.2)×1012/m2，；③Ⅲ期患者骨髓瘤细胞总数>1.2×1012/m2，血钙>2.99 mmol/L，骨骼X射线呈现进行性溶骨病变，血红蛋白<85 g/L，M蛋白IgA>50 g/L 、IgG>65 g/L。

1.4研究方法①淋巴细胞亚群检测：使用流式细胞仪对患者的淋巴细胞免疫表型进行检测，方法参照文献[7]：取出两组患者以及健康献血员新鲜的抗凝血标本各4 ml，用于血常规检测2 ml，另2 ml用于流式细胞仪(美国BD Bioscience生产，型号BD FACSEALIBUR)进行荧光抗体标记测验。检测过程中使用的单克隆抗体组成为：FITC-IgG1/PE-IgG1/PEcy5-IgG1、FITC-CD3/PE-CD16/PEcy5-CD19、FITC-CD3/PE-CD8/PEcy5-CD4、FITC-CD28/PE-CD81/PEcy5-CD4等。取标本中各100 μl放入指定样品测定管内，并加入相应荧光标记的单克隆抗体，振荡混匀、避光孵育，室温下静置20分钟后加入500 μl溶血素，同样振荡混匀、避光孵育，室温下静置8分钟。溶血完成后，在测定管内加入2 ml磷酸缓冲液，冲洗两遍后加入1 ml磷酸缓冲液混匀后上机检验。②脊髓染色体荧光原位杂交检测：采用荧光原位杂交技术来进行检测，方法参照文献[8]：取两组患者新鲜的抗凝骨髓液标本各4 ml，从中提取单个核细胞，对其进行低渗、固定处理，于-80 ℃环境中保存。杂交检测前一天滴片，室温下老化，第二天放置显微镜下观察，划定杂交范围。检测5种细胞的细胞遗传学异常，包含1q21扩增、D13 s319缺失、RB1缺失、P53缺失以及IGH易位。细胞遗传学异常阳性：异常信号>10%。③血清β2-MG的检测：采集MM患者空腹外周血5 ml，采用免疫比浊法检测血清β2-MG水平，仪器为OLYMPUS AU2700型的全自动生化分析仪。

1.5统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。非正态分布计量资料比较采用Wilcoxon检验，正态分布计量资料比较采用t检验；相关性分析采用Person直线相关法。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MM患者淋巴细胞亚群分析与对照组比较，不同年龄段的两组患者CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比明显升高(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比明显降低(P< 0.05)。见表1。

2.2细胞遗传学异常对MM患者淋巴细胞亚群的影响32例MM患者中有28例进行了脊髓染色体荧光原位杂交检测，本研究将高危遗传学改变定义为1q21扩增呈现阳性，P53缺失阳性及3个以上的染色体异常。将28例患者划分为高危细胞遗传学(FISH高危组)与无高危细胞遗传学(FISH无高危组)，分别为13例、15例。两组T淋巴细胞比例及绝对值比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。FISH高危组CD8+细胞比例、CD8+HLADR+/CD8+细胞比例明显高于FISH无高危组，CD4+CD28+/CD4+百分数明显低于FISH无高危组(P< 0.05)。见表2。

2.3MM患者淋巴细胞亚群与β2-MG的关系CD8+细胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比与血清β2-MG水平呈正相关(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比与β2-MG呈负相关(P< 0.05)，见表3。

表1 两组MM患者淋巴细胞亚群分析结果

表2 荧光原位杂交技术不同程度分层亚组患者的淋巴细胞亚群比较

表3 MM患者淋巴细胞亚群与生化指标的关系

3 讨论

MM是一种源自B淋巴细胞的恶性浆细胞疾病，作为B淋巴细胞发育到最终阶段的细胞，MM病症可以归类在B淋巴细胞的范围之中[9，10]。MM临床上主要表现为骨髓浆细胞的异常增生，伴有单克隆免疫球蛋白或者M蛋白过度产生。MM患者除了体液免疫功能缺陷外，细胞免疫功能也存在诸多异常[10～12]。T细胞在人体内不断更新，同一时间中能够存在不同的发育阶段或者功能，其中可将T细胞分为若干亚群，主要有：①辅助性T细胞，如Th(CD4+)细胞，主要能够辅助体液免疫、细胞免疫；②抑制性T细胞，如Ts细胞(CD3+/CD8+)，能够抑制细胞免疫、体液免疫；③效应T细胞，能够释放淋巴因子功能；④记忆T细胞，如CD4+细胞记忆亚群，能够记忆特异性抗原刺激等等。

有研究对MM患者淋巴细胞亚群分析，发现MM患者体内B细胞、NK细胞以及T细胞水平异常，由于年龄是影响MM患者生存期的危险因素，研究发现年龄>60岁患者中位生存时间显著短于年龄≤60岁患者[13]，所以本研究根据患者年龄分为45～60岁组和60岁以上组，并对两组与健康对照组淋巴细胞亚群进行分析。结果发现，45～60岁组CD4+细胞百分比显著升高，CD8+细胞百分比无明显变化，CD4/CD8比值明显升高，60岁以上组CD4+细胞百分比、CD4/CD8比值均无明显变化，CD8+细胞百分比明显升高，与之前研究结果不一致[14]。原因可能在与T细胞亚群构成复杂有关。CD4+T细胞可分为作用完全相反的不同亚群，如CD4+Th1和Th2细胞可使机体免疫功能增强，而Tregs细胞对机体免疫功能具有抑制作用，同样CD8+T细胞也可分为抑制性T细胞和细胞毒性T细胞，所以对CD4+T细胞和CD8+T细胞总体情况进行分析意义不大，需进一步细化分析。

CD4+CD28+/CD4+细胞百分比可反映CD4+T细胞功能，因为外周血T细胞增殖、分泌细胞因子除了需要MHC的呈递信号外，还需B7分子与T细胞上的CD28结合所提供的信号[12]。本研究发现，两个年龄组相对于对照组，CD4+CD28+/CD4+百分比均显著降低，FISH高危组相对于FISH无高危组，CD4+CD28+/CD4+百分比显著降低，提示MM患者免疫功能存在异常，CD28表达减少，无法被抗原呈递细胞激活产生细胞因子应答清除肿瘤细胞，且与细胞遗传学有关。CD8+T细胞主要包括CD3+CD4-CD8+CD28+细胞和CD3+CD4-CD8+CD28-细胞，CD3+CD4-CD8+CD28+细胞即杀伤性T细胞，是一类细胞毒效应细胞，对病毒感染或带有致敏抗原的肿瘤细胞具有特异杀灭作用。CD3+CD4-CD8+CD28-细胞即抑制性T细胞，通过抑制抗体产生和T细胞活化，发挥体液和细胞免疫抑制作用。本研究对杀伤性T细胞百分数进行了检测，发现两组CD8+CD28+/CD8+百分比与对照组比较均无明显变化，在FISH高危组和FISH无高危组之间差异也无统计学意义，提示MM患者杀伤性T细胞并未明显升高，若有CD8+T淋巴细胞增殖推测与抑制性T细胞增多有关。另外，HLADR和CD38是CD8+T细胞活化的标志性分子，本研究发现，相对于健康对照组，两组CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比均显著升高，相对于FISH无高危组，FISH高危组CD8+HLADR+/CD8+百分比显著升高，提示CD8+T细胞功能异常活化导致MM患者免疫功能下降，清除肿瘤细胞能力减弱，且与细胞遗传学有关。

MM的预后因素包括年龄、血红蛋白水平、肌酐水平β2-MG等，β2-MG水平能反映骨髓瘤细胞总量，是MM国际分期标准的参考因素之一[15]。本研究发现CD8+细胞、CD8+HLADR+/CD8+、CD4+CD28+/CD4+百分比与细胞遗传学有关，所以进一步通过Person直线相关性分析对三者与血清β2-MG水平进行分析，结果发现CD8+细胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比与血清β2-MG水平呈正相关，CD4+CD28+/CD4+百分比与β2-MG呈负相关，说明T细胞的异常与MM预后相关。

综上所述，外周血CD4+T细胞功能缺陷、CD8+T淋巴细胞异常增生以及CD8+T细胞功能异常活化是造成MM患者免疫功能缺失的主要原因，且与患者细胞遗传学危险度分层之间存在一定的相关性。细胞遗传学危险度在一定程度上决定了患者预后情况，为进一步确定免疫功能缺陷与MM预后的关系，本研究分析发现CD8+细胞、CD8+HLADR+/CD8+CD4+、CD28+/CD4+百分比均与预后因子血清β2-MG水平相关。所以以上三种细胞可能成为疾病预后的判断指标，值得临床深入研究。