胸苷磷酸化酶和血管内皮生长因子在大肠癌原发灶和淋巴结转移灶中的表达及意义

任建林，祝明洁，陈峰，姚晓虹

（1上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院病理科，上海202150；2上海交通大学医学院附属新华医院病理科，上海 200092）

大肠癌是常见的消化道肿瘤，大肠癌日趋增多的发病率及居高不降的病死率，使大肠癌的预后影响因素一直成为研究的热点。氟尿嘧啶类药物是大肠癌化学治疗的基础用药，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)广泛应用于大肠癌的化疗。胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是嘧啶核苷代谢中的关键酶, 作为5-FU的靶酶，它与肿瘤化疗效果、肿瘤的发展及预后有着密切的关系。TP与血小板源性内皮细胞生长因子在结构上一致，功能具有促进血管生成作用。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能诱导血管内皮细胞增殖，促进新生血管的形成，与肿瘤的生长和转移密切相关。

目前对大肠癌原发灶的TP、 VEGF表达已经作了大量的研究，而缺乏对相应淋巴结转移灶表达的探讨。本研究应用免疫组织化学方法，联合检测、分析大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶中TP和VEGF的表达，为个体化化疗提供实验依据。

材料与方法

1 病例

收集2010年1月至2012年3月间上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院诊治的有淋巴结转移的大肠腺癌患者，入组标准：根治性手术切除实体肿瘤；术后病理为腺癌；有5年以上随访资料(生存期) ；术前未经放疗及化疗，术后化疗方案以5-FU为主，化疗前进行全面检查以评估化疗耐受性。凡年龄＞ 80岁；有严重的心肺脑伴发病，严重的肝肾功能损害的病例不能入组。共入组33例。每例大肠癌原发灶、相应淋巴结转移灶、切缘正常组织标本均经苏木素-伊红（HE）染色（图1）。患者男性19例，女性14例，年龄45～80岁，平均年龄58±10岁，根据世界卫生组织（WHO）结直肠癌组织分类标准：低分化腺癌25例，中、高分化腺癌8例。

图1大肠癌原发灶（A）和淋巴结转移灶（B）HE染色观察。比例尺，25μmFig. 1 HE staining examination of primary colorectal cancer (A) and the metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

2 主要试剂

鼠抗人VEGF单克隆抗体（即用型）购自上海长岛抗体诊断试剂有限公司；鼠抗人TP单克隆抗体（即用型）购自北京中衫金桥公司；DAB显色试剂盒、PV6000通用型二步法免疫组化试剂盒、柠檬酸抗原修复液、PBS缓冲液均购自上海长岛抗体诊断试剂有限公司。

3 免疫组织化学染色

运用PV6000通用型二步免疫组织化学染色方法检测VEGF、TP，采用已知VEGF、TP阳性的大肠癌切片作为每批切片的阳性对照，采用PBS缓冲液代替一抗作为每批切片的阴性对照，染色步骤按PV6000通用型二步法免疫组织化学试剂盒提供的说明书进行。

4 结果判读

选取随机的中倍视野（10×10）4个，以400个细胞中阳性细胞的百分数计算，以着色深度及阳性细胞数目进行判定。VEGF主要定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色团块状或细颗粒状，弥漫分布；TP表达呈颗粒状棕黄色，细胞质、细胞核均可见表达。结果评分标准：阳性细胞所占的百分比＜10%记 0分，10%～25%记l分，26%～50%记2分，＞50%记3分；无显色记0分，浅黄色记1分，中等强度黄色记2分，棕或深黄色记3分；按阳性细胞所占的百分比及显色情况所得分相乘的分值判定各指标表达情况：0分判定为阴性(-)，1-4分判定为低表达(+)，＞4分判定为高表达(++)。

5 统计学分析

利用 SPSS 21.0 软件对数据做统计学处理，VEGF、TP在大肠癌原发灶与相应淋巴结转移灶之间表达的差异比较用卡方检验，VEGF与TP的相关性用Person相关分析，P＜0.05差别有统计学意义。

结 果

1 大肠癌原发灶及淋巴结转移灶中VEGF阳性表达率无差异

VEGF在少数正常大肠黏膜上皮细胞质弱表达，在大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶癌细胞胞质中等强度表达，在间质细胞及炎症细胞的细胞质弱至中等强度表达（图2）；大肠癌原发灶中癌细胞VEGF的阳性表达率为 21.2% ( 7/33)，相应淋巴结转移灶中癌细胞VEGF 的阳性表达率为 24.2%（8/ 33）。癌原发灶中VEGF的阳性表达率与 VEGF在相应淋巴结转移灶中的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）(表1)。

表1大肠癌原发灶与转移灶中VEGF表达比较Tab. 1 Comparison of expression of VEGF in primary colorectal cancer and metastatic lymphotic node

图2 VEGF在大肠癌原发灶（A）和转移灶（B）表达的免疫组织化学检测。比例尺，25μmFig. 2 Immunohistochemical examination of VEGF expression in primary colorectal cancer (A) and metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

2 大肠癌原发灶及淋巴结转移灶中TP阳性表达率无差异

TP在少数正常大肠黏膜上皮呈弱表达，在大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶的癌细胞中，尤其是浸润前沿的癌细胞，其表达强度高于癌巢中间；同时见间质的基质细胞、巨噬细胞也有TP表达（图3）。TP在原发灶癌细胞的低表达阳性率和高表达阳性率分别为6.1%（2/33）和93.9%（31/33），在淋巴结转移灶癌细胞的低表达阳性率和高表达阳性率分别为3.0%（1/33）和97.0%（32/33）。原发灶与转移灶癌细胞的TP高表达阳性率均超过90%，二者之间差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 大肠癌原发灶与转移灶TP表达强度比较Tab. 2 Comparison for expression level of TP in primary colorectal cancer and metastatic lymphotic node

3 TP在大肠癌原发灶及淋巴结转移灶的阳性表达率均高于VEGF

TP在大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶癌细胞中的阳性表达率均高于VEGF，有统计学意义（P＜0.05）(表3、表4) 。TP与VEGF的表达无相关性（Person相关系数r=-0.041，P＞0.05）。

表3 大肠癌原发灶中VEGF和TP表达水平比较Tab. 3 Comparison of expression levels of VEGF and TP in primary colorectal cancer

表4 大肠癌淋巴结转移灶中VEGF和TP表达水平比较Tab. 4 Comparison of expression levels of VEGF and TP in metastatic lymphotic node

图3 TP在大肠癌原发灶（A）和转移灶（B）表达的免疫组织化学检测。比例尺，25μmFig. 3 Immunohistochemical examination of TP expression in primary colorectal cancer (A) and metastatic lymphotic node (B). Scale bar, 25μm

4 原发灶间质细胞TP高表达、淋巴结转移灶中癌细胞VEGF不表达的患者生存率更高

随访显示，33例病例中其中7例的平均生存期为71个月，5年生存率为53%，明显高于其余26例（平均生存期为38个月，5年生存率为20%）。在7例预后较好的病例中，原发灶炎症反应明显，间质细胞TP表达明显（图4A），淋巴结转移灶中癌细胞VEGF不表达（图4B）（表5）。

图4 预后较好病例原发灶TP表达和转移灶VEGF表达的免疫组织化学检测。比例尺，25μmFig. 4 Immunohistochemical examination of TP expression in the primary tumor (A) and VEGF in metastatic lymphotic node (B) of the cases with better prognosis. Scale bar, 25μm

表5 VEGF和TP表达与预后关系的统计学分析Tab. 5 Statistical analysis for the relationship of VEGF and TP expression with prognosis

讨 论

大肠癌患者确诊时约35%为中晚期,即使是早期发现的患者也有约一半会发生术后转移、复发[1]。术后化疗是治疗大肠癌的重要手段，氟尿嘧啶类药物，包括5-FU、氟铁龙、卡培他滨等是大肠癌化疗的主要药物[2]。患者对5-FU的敏感性存在个体差异，如何预测化疗方案的疗效是大肠癌个体化治疗需解决的问题。

TP能催化5-FU与1-磷酸2-脱氧核糖反应，其终产物能够抑制DNA合成，有抗癌活性，与肿瘤的化疗关系密切。TP同时又是5-FU前体药物（氟铁龙和卡培他滨）转化为5-FU的一个关键限速酶。卢振霞等[3]通过免疫组织化学方法检测了58例大肠癌患者的正常黏膜和癌组织中TP的表达，发现大肠癌组织中TP的表达明显高于正常黏膜；TP在有淋巴结转移的大肠癌中阳性表达率较高。Haraguchi等[4]研究TP与大肠癌转移的关系发现：有转移的大肠癌患者血清中的TP水平明显增高，肿瘤组织内TP表达情况与转移无关。我们的研究发现大肠癌原发灶癌细胞的TP低表达和高表达阳性率分别为9.1%和90.9%，淋巴结转移灶癌细胞的TP低表达和高表达阳性率分别为3.0%和97.0%。这些结果提示：大肠癌原发灶和转移灶之间的癌细胞TP表达水平不存在明显差异，有淋巴结转移的大肠癌细胞的TP表达水平不能预测癌细胞对以5-FU为基础的化疗的反应。但是，Inokuchi等[5]通过RT-PCR方法检测大肠癌原发灶与肝转移病灶中TP的mRNA水平发现：在原发灶和肝转移病灶中TP的mRNA水平有明显差异。这些结果的不同可能与患者的数量、检测TP的方法有关，也可能与TP蛋白的不同亚型在肿瘤化疗中发挥的作用不同有关。

目前，关于TP的研究主要集中在癌细胞，关于大肠癌及相应转移组织中TP表达的部位报道不一致。张继民等[6]应用免疫组织化学方法对40例结直肠癌标本研究中发现，TP在大多数基质细胞、特别是巨噬细胞表达。Kobayshid等[7]应用电子显微镜观察TP在直肠癌中的分布，发现TP大多分布于巨噬细胞的细胞质。游伟等[8]应用免疫组织化学方法对28例结直肠癌肝转移标本进行研究，发现肿瘤相关巨噬细胞表达TP。Nozawa、 Yasuno等[9-10]的研究表明：肿瘤细胞产生的TP主要参与血管生成, 基质细胞产生的TP主要参与局部免疫反应。我们的研究发现：TP在大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶的癌细胞中表达，同时在基质细胞、巨噬细胞及炎症细胞也有表达；7例预后较好的病例中，我们观察到原发灶炎症反应明显，炎症细胞、间质细胞TP表达明显。由以上结果我们推测：大肠癌癌细胞和间质细胞表达的TP具有结构和功能上的差异。癌细胞表达的 TP可能主要刺激肿瘤的血管新生，与肿瘤的侵袭性相关；间质细胞表达的 TP可能参与局部免疫反应，改善患者的预后，癌组织中浸润的炎症细胞表达TP也会影响癌细胞的生物学行为。间质细胞及炎症细胞TP的表达水平可能预测以5-FU为基础的化疗的反应，但由于TP在正常黏膜间质内也有表达,因此尚需大样本进一步研究其意义。

VEGF促进内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖[11-13]。TP刺激内皮细胞趋化和生长，促进血管生成，缺氧可诱导TP的表达[14]。我们的研究发现TP主要表达于浸润边缘的癌细胞，推测与此区域缺氧有关系，周围浸润的单个细胞TP表达阳性强度强于癌巢中间。Akiyama S等[15-16]研究发现：TP通过催化胸苷，得到了次级产物 2-脱氧D核糖，局部组织产生大量的氧自由基，处于氧化应激状态后诱导VEGF表达，最终TP和VEGF促进血管生成。近年来王书奎等[17]研究发现：消化道恶性肿瘤患者血清中的VEGF及TP水平显著高于消化道良性疾病患者及健康对照组。Liekens S等[18]研究发现，在血管丰富的肿瘤(乳腺癌、肺癌、结直肠癌等)有TP和VEGF的共同表达。临床上TP抑制剂增强以VEGF通路为靶点的药物治疗效果，提示TP和VEGF共同来刺激血管生成[19]。我们的研究发现：大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶癌细胞中的VEGF及TP表达水平均显著高于正常大肠黏膜上皮；TP和VEGF在大肠癌共同表达，共同来刺激血管生成，与大多数文献报道是一致的。虽然目前VEGF的抑制剂已成为抗肿瘤药物[20]，但我们的研究结果发现：VEGF在大肠癌原发灶及淋巴结转移灶癌细胞中的阳性表达率分别为 21.2%和 24.2%， TP在大肠癌原发灶及相应淋巴结转移灶癌细胞中的阳性表达率均高于VEGF。我们推测TP在大肠癌组织中的血管生成作用大于VEGF，TP在有淋巴结转移的大肠癌中主要发挥血管生成作用，促进肿瘤的侵袭性。我们发现在7例预后较好的病例中，淋巴结转移灶的癌细胞不表达VEGF，VEGF不表达是否能预测化疗的反应有待进一步研究。

总之，大肠癌原发灶和淋巴结转移灶之间的TP、VEGF表达水平不存在显著差异，TP在肿瘤细胞和基质细胞中的表达有不同的作用。对于有淋巴结转移的病例，间质细胞及炎症细胞的TP表达水平可预测癌细胞对以5-FU为基础的化疗的反应，而癌细胞TP表达水平不具备预测意义。TP介导的血管生成可能是结直肠癌进展和转移的重要因素。