非小细胞肺癌患者中EGFR突变、ALK和ROS1融合基因表达变化及其临床病理学意义

白冬雨，张海萍，索文昊，高德宏，钟山

(厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003)

肺癌随着其发病率和死亡率的逐年攀升，已跃居恶性肿瘤之首，其中80%以上是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。近年来，以分子靶向治疗为核心的个体化治疗已成为肺癌治疗的研究热点。目前NSCLC的治疗使用最多的是针对表皮生长因子受体（epidermic growth factor receptor，EGFR）突变的分子靶向药物，即小分子的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），其对存在EGFR突变的NSCLC患者具有明显的临床疗效。继发现EGFR基因突变之后，棘皮动物微管相关蛋白样4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4）与间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因EML4-ALK[2-4]和原癌基因蛋白酪氨酸激酶ROS（ROS1）被发现，对于存在ALK基因融合和ROS1基因融合的患者给予ALKTKI克唑替尼（crizotinib）靶向治疗，可取得较好的疗效。因此靶向治疗前检测EGFR、ALK和ROSl基因突变对于靶向治疗疗效预测和适宜患者筛选具有重要意义。

本研究通过检测379例NSCLC患者的EGFR、ALK、ROS1基因表达情况，分析阳性患者的临床病理特征，为筛选分子靶向治疗适宜人群提供一定的数据支持。

材料与方法

1 标本及一般资料

收集我院379例手术切除经病理确诊的NSCLC患者石蜡包埋组织。其中男性250例，女性129例；年龄范围19～87岁，中位年龄60岁，按中位年龄分2组，＜60岁：179例，≥60岁：200例。有吸烟史172例，无吸烟史207例。腺癌215例，鳞癌95例，腺鳞癌24例，其他类型45例。

2 实验方法

2.1 DNA和RNA提取

取≥5片5μm厚度石蜡切片，置于1.5ml EP管内。使用厦门艾德生物医药有限公司的甲醛固定石蜡包埋样本DNA/RNA共分离试剂盒（离心柱型）提取DNA和RNA。具体步骤按试剂盒操作说明。

2.2 EGFR、ALK和ROS1融合基因检测

按照人类EGFR基因突变定性检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技有限公司),人类ALK/ROS1基因融合联合检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）及人类EGFR/ALK/ROS1基因融合联合检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技有限公司）说明书提供的方法，在Mx3000P实时荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司）中进行扩增，基因检测位点见使用说明书。将从石蜡包埋组织中提取的RNA按照试剂盒说明书操作逆转录成cDNA，然后连同提取的DNA一起进行实时荧光PCR。

2.3 Sanger DNA测序试验

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用PCR引物序列。每个样品分别经EGFR/ALK/ROS1的测序引物和断裂点的上下游引物进行扩增，将扩增出的PCR产物送至上海生工生物工程公司纯化、测序。

3 统计学分析

所有数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。结果运用χ2检验及Fisher确切概率法，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义（双侧检验）。

结 果

1 非小细胞肺癌的病理学特征

HE染色显示，肺鳞状细胞癌肿瘤细胞排列呈实性巢状，部分区域呈基底样排列，细胞核增大，核染色质粗，胞浆略丰富，可见核仁及核分裂像，局部可见不良角化（图1A）；肺腺癌肿瘤细胞排列呈腺泡状和腺管状，由立方或柱状细胞组成，核增大深染（图1B）。免疫组织化学染色显示，肺鳞状细胞癌肿瘤细胞CK5/6阳性（图1C），肺腺癌肿瘤细胞CK7阳性（图1D）。

2 EGFR基因突变检测结果及其与临床病理特征的关系

379例NSCLC患者肺癌组织，EGFR突变率为36.15%（137/379），其中18外显子突变率0.73%（1/137），19外显子突变率39.42%（54/137），20外显子突变率3.65%（5/137），21外显子突变率56.20%（77/137）。其中发现6例两个位点同时突变的病例，包括4例21外显子L858R位点突变合并20外显子T790M位点突变，2例19外显子缺失突变合并21外显子L858R位点突变。

在379例NSCLC患者中,女性患者EGFR突变率（56.59%，73/129）显著高于男性患者（25.60%，64/250）；腺癌患者EGFR突变率（60.00%，129/215）显著高于鳞癌患者（6.32%，6/95），非吸烟患者EGFR突变率（54.23%，109/201）显著高于吸烟患者（15.73%，28/178）,年龄＜60岁患者EGFR突变率（39.11%，70/179）略高于年龄≥60岁患者（33.50%，67/200），但差异无统计学意义（χ2=1.286，P＞0.05）。

图1 非小细胞肺癌的病理学特征。A，鳞状细胞癌HE染色；B，腺癌HE染色；C，鳞状细胞癌中CK5/6表达的免疫组织化学染色；D，腺癌中CK7表达的免疫组织化学染色；比例尺，100μmFig. 1 Pathological features of non-small cell lung cancer. A, HE staining of squamous cell carcinoma; B, HE staining of adenocarcinoma; C, immunohistochemical staining of CK5/6 expression in squamous cell carcinoma; D, immunohistochemical staining of CK7 expression in adenocarcinoma; scale bar, 100μm

表1 非小细胞肺癌患者EGFR/ALK/ROS1基因突变与临床特征的相关性Tab.1 Correlation between EGFR/ALK/ROS1 gene mutations and clinical features in patients with non-small cell lung cancer

3 ALK融合基因表达及其与临床病理特征的关系

379例NSCLC患者肺癌组织，ALK融合基因阳性率3.43%（13/379），其中M1型[EML4-ALK(E13;A20)]4例、M2型[EML4-ALK(E6;A20)]3例、M3型[EML4-ALK(E20;A20)]3例、M4型[EML4-ALK(E15del60;del71A20)]1例、M6型 [EML4-ALK(E18;A20)]2例，未检测到M5、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13和 M14 型。

379例NSCLC患者中女性患者ALK融合基因阳性率（4.65%，6/129）略高于男性患者（2.80%，7/250），但差异无显著性（χ2=0.88，P＞0.05）；腺癌患者ALK融合基因阳性率（4.65%，10/215）略高于鳞癌患者（1.05%，1/95），但无统计学意义（χ2=2.493，P＞0.05）；年龄＜60岁患者ALK融合基因阳性率（4.47%，8/179）高于年龄≥60岁患者（2.50%，5/200），但两者差异无统计学意义（χ2=1.106，P＞0.05）；非吸烟患者ALK融合基因阳性率（4.98%，10/201）高于吸烟患者（1.69%，3/178），但差异也无显著性（χ2=3.084，P＞0.05）。

4 ROS1融合基因检测结果及其与临床病理特征的关系

379例NSCLC患 者 肺 癌 组 织，ROS1融合基因阳性率3.17%（12/379），其中M8型 [CD74-ROS1(CD6;R34)]9例、M3型 [CD74-ROS1(CD6;R32)]1例（其中1例为M3和M8双融合阳性）、M7型[SLC34A2-ROS1(SL14del;R34)]1例、M12型 [LRIG3-ROS1(LR16;R35)]1例、M14型[GOPC-ROS1(GO4;R36)]1例，未检测到M1、M2、M4、M5、M6、M9、M10、M11 和 M13 型。

379例NSCLC患者中女性患者ROS1融合基因阳性率（5.43%，7/129）高于男性患者（2.00%，5/250），两者差异无统计学意义（χ2=3.258，P＞0.05）；腺癌患者ALK融合基因阳性率（2.79%，6/215）高于鳞癌患者（2.11%，2/95），两者差异无统计学意义（χ2=0.123，P＞0.05）；年龄＜60岁患者ALK融合基因阳性率（3.91%，7/179）高于年龄≥60岁患者（2.50%，5/200），两者差异无统计学意义（χ2=0.613，P＞0.05）；非吸烟患者ALK融合基因阳性率（3.98%，8/201）高于吸烟患者（2.25%，4/178），两者差异无统计学意义（χ2=0.925，P＞0.05）。

5 EGFR/ALK/ROS1基因融合联合检测

379例NSCLC患者中，对其中77例采用EGFR/ALK/ROS1基因融合联合检测试剂盒进行检测，发现EGFR突变率为35.06%（27/77），ALK融合基因阳性率为1.30%（1/77），未检测出ROS1融合基因。

讨 论

据国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示，我国新发肺癌患者例数和死亡例数已居所有恶性肿瘤之首[1]。近十年来，随着分子医学的进展和靶向药物的不断发现，非小细胞肺癌的治疗已进入到一个个体化分子靶向精准治疗的时代。随着治疗靶点EGFR的发现和相应靶向药物EGFR-TKIs的问世，其后针对ALK与ROS1突变的相应的靶向药物crizotinib也投入临床NSCLC的靶向治疗中。研究表明[2-4]，存在EGFR、ALK和ROS1基因突变的NSCLC患者可在相应的靶向治疗中获益，因此检测EGFR、ALK和ROS1基因突变对于筛选靶向治疗适宜患者具有重要的临床意义。

EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，该区域的激活即磷酸化对癌细胞增殖、生长的相关信号传递具有重要意义。EGFR突变主要包括4种类型：外显子19缺失突变、外显子21点突变、外显子18点突变和外显子20插入突变，其中19外显子缺失突变（19del）和21外显子点突变（L858R）是最常见的对EGFR-TKI治疗敏感的突变。本研究检测379例NSCLC患者， EGFR突变也是以19外显子和21外显子突变为主，同时发现6例两个位点同时突变的病例，包括4例21外显子L858R位点突变合并20外显子T790M位点突变，2例19外显子缺失突变合并21外显子L858R位点突变。大量研究结果显示[5-7]，EGFR突变的发生率在女性、非吸烟者、腺癌、亚裔人群中发生频率较高,本研究发现女性、腺癌、非吸烟者的EGFR突变率明显高于男性、鳞癌和吸烟者，且两者差异有统计学意义。

2007年Rikova等[8]和Soda等[9]分别发现肺癌中存在EML4-ALK融合基因变异现象，且该基因变异具有致癌性，明确了EML4-ALK融合基因是肺癌的驱动基因之一。肺癌另一个驱动基因ROS1与ALK二者氨基酸序列上具有近49%的相似性，而在激酶催化区的ATP结合位点同源性高达77%[10]。

国内外研究数据表明[11-13]，ALK融合基因在非小细胞肺癌患者中的阳性率为3%-7%。ROS1融合基因在非小细胞肺癌中的阳性率为1.0%-3.4%[14]，且ALK与ROS1两个基因型的肺癌在临床特征上也非常相似。本研究检测结果显示，ALK融合基因阳性率3.43%，ROS1融合基因阳性率3.17%，女性、腺癌、年龄＜60岁、非吸烟者的ALK融合基因阳性率比较高，但差异无统计学意义，我们认为造成不同差异的原因可能与人种选择、研究人群的筛选及不同的检测方法有关[15]，也与本研究中样本量不够大有关。

实验数据显示E13;A20、E6ins33;A20、E20;A20这三种融合类型的例数最多，与Sasaki等[16]研究相一致。而ROS1中CD74 exon6;ROS1 exon34融合类型最多，与国内学者研究相一致[17]。

本实验中有77例采用了EGFR、ALK、ROS1联合检测试剂盒，EGFR多基因检测结果与单基因检测结果基本一致，ALK、ROS1多基因检测结果低于单基因检测结果，可能与病例数较少有关。完成多基因联合检测多需的标本量与单基因检测所需的标本量相同，同时检测周期可缩短1天。

目前非小细胞肺癌中需要检测靶点越来越多，为了提高检测的有效性同时兼顾技术的可行性，专家组推荐使用经过认证的多靶点检测技术，对EGFR、ALK、ROS1同时检测[18]。本研究中有77例使用了EGFR、ALK、ROS1联合检测试剂盒，与以往的单独分别检测比较既节约了组织，又提高了检测效率、缩短了检测时间，是一种适用于临床的高效、经济、快速的NSCLC驱动基因突变检测平台。