基质Gla蛋白在大鼠附睾发育过程中的表达及定位

马赫，张葆荔，刘宝英，马斌芳，李臻*

（1第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室，西安 710032；2上海科技大学生命科学与技术学院，上海 201210）

附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护的重要器官[1]。附睾管腔的离子浓度受到多种通道蛋白和离子泵的精细调控，其中钙离子的浓度远低于血液钙离子浓度，且管腔内钙离子浓度沿头体尾部呈梯度降低[2]。低钙环境可以维持精子静息状态，防止精子提前激活，而附睾管腔钙离子浓度异常升高将导致精子过早活化，精子运动功能降低，甚至雄性生育缺陷或不育[3]，然而附睾管腔钙稳态的调节机制仍未被充分阐明。

基质Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）是一种分子量为12 kDa的分泌性蛋白，含有5个γ谷氨酰基残基[4]。作为维生素K2（vitamin K2, VK2）依赖的异位钙化抑制因子，MGP需要在VK2充足的情况下被γ-谷氨酰基羧化酶（γ-glutamyl carboxylase，GGCX）羧化激活从而发挥作用。被羧化激活的MGP可结合钙离子或钙晶体，防止组织局部游离钙浓度过高和钙盐沉积[5]。以往对VK2依赖的MGP对钙稳态调节的研究大多集中在血管钙化和慢性肾病上，而这种重要的钙调控机制在男性生殖系统，尤其是需要维持低钙环境的附睾中的作用仍未被探究。本文采用实时定量PCR和免疫荧光染色技术，检测MGP在大鼠附睾发育过程中的表达及定位，为今后深入探究其在维持附睾管腔钙稳态的作用机制奠定了基础。

材料与方法

1 组织材料

健康雄性SD大鼠，出生后6d、10d、3w、5w、7w、8w、10w及12w各3只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。3%戊巴比妥钠以50 mg/kg体重腹腔麻醉，取左侧附睾置于4%多聚甲醛固定过夜，梯度蔗糖脱水后Tissue-Tek OCT包埋，冰冻切片（10μm）用于免疫荧光染色。取右侧附睾用于提取RNA进行实时定量PCR分析。

2 主要试剂

RNA提取液Trizol Reagent、反转录试剂盒qPCR RT Master Mix以及SYBR Green PCR Master Mix均购自德国Qiagen公司；大鼠内参18S购自生工生物工程（上海）股份有限责任公司；兔抗MGP多克隆抗体（ab192396）购自英国Abcam公司，鸡抗B1-VATPase多克隆抗体由Sylvie Breton教授馈赠，Cy3标记山羊抗兔，FITC标记驴抗鸡荧光二抗均购自美国Jackson公司；含DAPI封片剂购自英国Abcam公司；组织包埋剂Tissue-Tek OCT购自美国Sakura公司。

3 实时定量PCR

新鲜附睾组织100mg，冻存于液氮中，冰上研磨成粉末后Trizol法提总RNA，在10μl 体系中加入0.8μg RNA，用逆转录试剂盒以 37°C 15min、85°C 5s反应条件合成cDNA。实时定量PCR采用20μl体系，MGP上下游引物分别为：5’-CAGCCCTGTGCTATGAATC-3’；5’-AAGGTGTTGGCATTTCTCC-3’。反应条件为 95°C 30s；95°C 5s，60°C 30s，40 个循环。每次扩增均设目的基因组和内参基因组及空白对照组，根据测得CT值，以大鼠18S为内参，采用ΔCt法计算MGP mRNA的相对表达量。

4 免疫荧光染色

组织冰冻切片在PBS中水化后，1% SDS/PBS孵育4min，1% BSA室温封闭2h，兔抗MGP多克隆抗体（1∶100）4°C孵育过夜，Cy3标记山羊抗兔二抗（1∶400）室温孵育2h，鸡抗B1- VATPase多克隆抗体（1∶500）室温孵育2h，FITC标记驴抗鸡二抗（1∶60）室温孵育2h，封片剂（含DAPI）封片。用一抗稀释液代替一抗作为阴性对照。封片后激光共聚焦显微镜下观察并照相。

结 果

1 MGP mRNA在大鼠附睾不同发育阶段的表达

对大鼠附睾发育过程各个关键时间节点提取的mRNA进行实时定量PCR检测，结果显示在大鼠附睾发育不同阶段均有MGP mRNA的表达，在附睾发育分化初始阶段（6d）表达量较低，6d至3w表达量逐渐升高并于3w达到高峰，随后3～8w MGP mRNA的表达量逐渐降低，在大鼠成年后（10～12w）其表达量逐渐升高并稳定在较高水平（图1）。

图1 MGP mRNA在大鼠附睾不同发育阶段表达变化的实时定量PCR检测Fig.1 Detection for MGP mRNA expression in the rat epididymis at differrrent developmental stages by qRT-PCR

2 MGP蛋白在不同发育阶段大鼠附睾组织的定位

为进一步明确MGP在大鼠附睾发育过程的定位情况，我们利用免疫荧光染色观察了MGP在附睾发育过程不同节段的表达。红色荧光信号标记的MGP在10d大鼠附睾组织起始部、头部、体部和尾部均有少量表达。在3w大鼠附睾中， MGP信号较10d时增强，在附睾的各个节段均有表达。在7w大鼠附睾中，MGP的表达主要集中于附睾体部，尾部也有少量表达，而附睾起始部和头部无明显阳性信号。MGP在12w大鼠附睾组织的表达仍集中在体部和尾部，头部有少量表达，但附睾起始部无明显表达。此外，MGP与绿色荧光信号标记的亮细胞标志物B1-vATPase共存，表明MGP不仅表达于附睾上皮广泛存在的主细胞内，还在亮细胞中有表达（图2）。

图2大鼠不同发育阶段附睾组织MGP表达的免疫荧光检测。IS，initial segment；CPT，caput；CPS，corpus；CD，cauda；红色，MGP；绿色，B1-vATPase；黄色，双标；比例尺，20μmFig. 2 Immunofluorescent staining identification of MGP in various developmental stages of rat epididymis. IS, initial segment; CPT, caput; CPS, corpus; CD, cauda; red, MGP; green, B1-vATPase; yellow, double labelling; scale bar, 20μm

讨 论

哺乳动物的附睾在出生后要经历复杂的胚胎后发育过程才能成熟，附睾上皮逐渐分化成熟为不同种类的细胞后，对各种蛋白和离子高效动态的分泌与重吸收，逐步建立起稳定精密的附睾管腔微环境[6]。在生理状态下，精子在附睾中的成熟和维持静息状态高度依赖附睾微环境的稳态，其中，附睾管腔钙离子的稳态对精子运动、代谢、顶体反应等有至关重要的影响[2]。MGP作为钙离子结合蛋白，在多种组织器官发挥重要的钙稳态调控作用[4]，因此，探究MGP在大鼠附睾胚胎后发育过程的表达和定位，将有助于揭示其与附睾上皮成熟和附睾管腔微环境稳态，尤其是钙离子稳态的建立过程的关系，为进一步探究其在附睾中的具体功能打下基础。

从形态学角度划分，附睾的胚胎后发育通常经历3个阶段，分别为未分化期（出生后1～15d），分化期（出生后16～44d），增长期（出生44d后）[6]。此外，附睾的胚后发育还存在一些关键的时间节点，比如在3w时睾丸输出小管形成，睾丸支持细胞（Sertoli cell）分泌的物质经由输出小管运送到附睾，并调控附睾上皮细胞蛋白的表达[7]。我们的结果表明，MGP mRNA在附睾胚胎后发育未分化期内表达量较低，而从6d至3w表达量逐渐升高并于3w达到顶峰，与睾丸内物质运输到附睾的时间节点相对应。研究表明MGP的启动子含有维甲酸反应元件（RA response element，RARE），维甲酸可激活其转录[8]，而哺乳动物睾丸组织含有丰富的维甲酸合成酶，睾丸内维甲酸的主要来源为支持细胞[9]。因此我们推测MGP mRNA在3w的高表达与睾丸来源的维甲酸的转录激活作用有关。免疫荧光结果显示，MGP在出生后10d和3w均在大鼠附睾各个节段广泛表达，未呈明显的节段特异性。MGP这种在胚胎后器官发育早期的广泛表达也见于肾脏、肺、脾脏等组织器官，提示其对器官胚胎后发育的重要性。最近的研究表明，MGP通过与骨形成蛋白-4（bone morphogenetic protein 4, BMP-4）相互作用在胚胎期和胚胎后发育中参与肺叶分支的形态发生[10]。此外，在骨骼肌的早期发育过程MGP可调节生肌调控因子的表达以及影响细胞外基质的重塑[11]。综上我们推测，MGP在大鼠附睾胚胎后发育早期的表达可能参与调控附睾管腔形态的发生。

在附睾胚胎后发育的晚期（出生后5～6w），附睾上皮细胞分化成熟，蛋白表达模式与成年个体附睾相似[6]。另外两个关键的时间节点为出生后7w，精子到达附睾头部；出生后8w，精子到达附睾尾部[7]，在7～8w精子到达附睾时，附睾管腔微环境稳态的建立，尤其是对精子生理活动影响重大的钙离子稳态的建立至关重要。我们的结果显示，MGP mRNA从出生后7～8w至12w表达量逐渐升高并维持在较高水平，提示MGP可能参与附睾管腔微环境的调控，为精子到达附睾后的成熟和储存提供适宜条件。MGP是重要的组织异位钙化抑制因子，基因型为MGP－／－的敲除鼠通常由于大血管钙化、破裂，在6～8w龄前死亡。类似的大血管钙化现象也在MGP羧化激活被抑制的大鼠模型中被观察到[4]。体外实验也表明，血管平滑肌细胞分泌的MGP激活被抑制后，细胞外钙离子浓度显著增高[12]。综上，我们推测MGP在附睾胚胎后发育7～8w至个体成熟过程主要发挥附睾管腔钙稳态的调控作用。附睾管腔钙离子浓度由起始部至尾部呈梯度降低趋势，并远低于血钙浓度，但附睾管腔维持低钙稳态的机制仍未被研究清楚。最近的研究表明钙离子通道蛋白TRPV6和协同参与钙离子跨上皮转运的氯离子通道蛋白TMEM16A主要在附睾尾部远端参与管腔钙离子调控，但这种维持低钙水平的机制在头部，体部和尾部近段并不存在[13]。免疫荧光检测显示，在7w和12w大鼠附睾MGP的表达呈节段特异性，主要在附睾体部和尾部表达较高，这提示MGP可能在缺乏TRPV6-TMEM16A钙调控的附睾体部和尾部发挥钙稳态的维持作用。此外，MGP广泛表达于附睾上皮主细胞和亮细胞提示MGP对钙稳态的调节可能涉及复杂蛋白的分泌与内吞过程，其具体机制还有待进一步研究。需要指出的是，本实验中MGP mRNA在大鼠附睾不同发育节点的表达量有趋势变化，3w达峰值，但相邻时间节点之间并无统计学差异，有待后续实验扩大样本量进一步验证。

MGP在大鼠附睾胚胎后发育早期广泛表达于各个节段提示其可能参与附睾管腔早期的形态发生，在发育晚期至附睾成熟后MGP在体部和尾部的节段性高表达表明其可能发挥附睾管腔钙稳态调控的作用。MGP对附睾发育的调控和附睾管腔钙稳态的调节机制仍有待进一步阐明，这将有助于揭示男性精子成熟的稳态调节，进一步阐明男性不育的发病机理。