ELAM-1在鼻咽癌裸鼠移植瘤中的表达及其与转移的关系

刘露 刘丽娟 李印 黄晓新 康巍 韦波 苏丹柯 金观桥

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院医学影像中心

2018年全球癌症统计数据显示，鼻咽癌新发病例129 079例，死亡病例72 987例［1］。鼻咽癌局部控制率已明显提高，但远处转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因。初诊鼻咽癌患者中有4%～10%已发生远处转移，治疗后仍有15%～30%发生远处转移［2］，因此研究鼻咽癌转移相关分子标志物对预后评估和制定治疗方案具有重要意义［3］。内皮细胞表达的E-选择素（ELAM-1）与肿瘤细胞表达的配体sLex或sLea特异性结合，可以介导肿瘤细胞与内皮细胞、细胞外基质的黏附和识别，促进转移发生。WENZEL等［4］研究认为ELAM-1是促进头颈鳞癌转移的分子标志物之一，它在肿瘤细胞的黏附、运动、穿出等环节中起重要作用，但未通过体内实验进一步验证。本研究旨在建立稳定性好且与人鼻咽癌生物学特性相似的裸鼠移植瘤转移模型，并检测荷瘤裸鼠移植瘤组织中ELAM-1的表达，探讨其与鼻咽癌转移的关系，为阐明鼻咽癌转移机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与细胞株

16只BALB/c雌性裸鼠购自广西医科大学动物实验中心（许可证号：SCXK桂2014-0002），体重13～15 g，鼠龄5周，随机分配到4笼，每笼4只，饲养于广西医科大学动物实验中心SPF级实验室，饲养条件为温度20～27℃，湿度45%～65%，给予灭菌水和饲料。鼻咽癌SUNE-1亚株5-8F（高成瘤、高转移细胞）购自美国ATCC公司，采用苏州净化设备仪器厂超净工作台和美国Thermo公司细胞培养箱，在37℃、5%CO2饱和度条件下培养细胞。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型构建 用规格为1 mL的注射器抽取0.02 mL细胞悬液（生理盐水重悬对数生长期的5-8F细胞，浓度为1×108个/mL），约含2×106个细胞，注射于已经酒精消毒的裸鼠左后肢爪垫，缓慢退针。每隔2 d观察裸鼠生长状态和成瘤情况，测量裸鼠体重及移植瘤长短径，并根据公式V=a×b2×1/2（V为体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径）计算裸鼠移植瘤体积。在第8周以颈椎脱臼方式处死裸鼠。

1.2.2 HE染色检测鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的转移情况 移植瘤、淋巴结组织和其他转移组织标本用10%中性福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、4 μm厚切片，二甲苯和梯度无水乙醇脱水，用Harris苏木精水溶液将石蜡切片染色4～8 min，将石蜡切片放入酒精伊红染色液中2～3 min，中性树胶封固，显微镜下观察。移植瘤、淋巴结组织和其他转移组织内发现癌细胞时即确定为转移灶，根据是否出现转移瘤，将裸鼠分为转移组和非转移组。

1.2.3 免疫组化SP法检测ELAM-1的表达水平 4 μm厚切片常规脱蜡至水，预热EDTA修复液（pH8.0）进行抗原修复，滴加1滴或50 μL过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10 min，滴加稀释好的一抗（ELAM-1鼠抗人单克隆抗体，稀释浓度为1∶100；美国默克密理博公司），37℃湿盒中孵育1 h，滴加二抗（即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTM SP检测试剂盒，福州迈新公司），室温孵育20 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木素复染30 s后脱水、透明、封片，显微镜下观察染色情况。

免疫组化定量分析：在移植瘤切片中选取染色均匀、背景干净且无坏死的区域，用EVOS FL Auto全自动细胞成像系统进行图像采集（×400倍，曝光条件保持一致），用Image J软件（V1.51）将图像中的阳性区域转为灰度图像［5］，并计算出平均光密度值（OD），OD值越大表示ELAM-1表达水平越高。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计量资料数据用均数±标准差（±s）表示。采用独立样本t检验比较转移组与非转移组中ELAM-1的表达水平、裸鼠原始体重及4～7周后裸鼠瘤体体积的差异。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型肿瘤生长及转移情况

裸鼠造模后1周均成瘤，成瘤率为100.0%。约30 d，裸鼠左侧腹股沟可触及肿大淋巴结，见图1。HE染色结果显示，10只裸鼠发生转移（转移组），转移率为62.5%，其中7只仅淋巴结转移，1只仅腹盆腔转移，2只既发生淋巴结转移又出现腹盆腔转移；6只裸鼠未发生转移（非转移组）。两组裸鼠原始体重差异无统计学意义［（13.83±0.56）gvs（14.62±0.30）g，t=1.026，P=0.071）］。绘制裸鼠移植瘤生长曲线，16只裸鼠潜伏期为7～14 d，造模后4～7周，瘤体体积呈指数形式增长，且转移组移植瘤增长速度较非转移组快，非转移组裸鼠瘤体体积小于转移组［（198.91±163.29）mm3vs（268.76±174.31）mm3，t=4.376，P=0.005］，见图 2。

图1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型淋巴结转移情况Fig.1 Lymph node metastasis in nude mice

图2 裸鼠鼻咽癌移植瘤生长曲线Fig.2 Growth curves of transplanted tumor of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

2.2 鼻咽癌裸鼠移植瘤及转移组织的HE染色结果

显微镜下观察可见移植瘤组织及腹盆腔转移组织的癌细胞呈卵圆形或圆形，核大、深染为深蓝色、核分裂像增多、核质比增大，细胞异形性显著，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。组织结构异形性明显。

转移组淋巴结的HE染色显示，正常淋巴组织中可见散在大小不等的癌巢，癌细胞细胞核为深蓝色且异形性明显，胞浆及纤维组织为深浅不一的红色；部分癌巢内可见大片坏死，与人鼻咽癌细胞形态一致，见图3。

图3 鼻咽癌裸鼠移植瘤及转移组织的淋巴结HE染色结果（HE×400）Fig.3 HE staining results of lymph node xenografts and metastatic tissues of nasopharyngeal carcinoma in nude mice（HE×400）

2.3 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表达情况

所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、转移淋巴结及远处转移瘤中的ELAM-1表达均为阳性，主要表达于细胞膜。转移组移植瘤OD值大于非转移组（0.4497±0.0705vs0.0435±0.0082，t=4.388，P=0.001），表明转移组移植瘤ELAM-1的表达水平高于非转移组，见图4。

图4 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表达水平Fig.4 Expression level of ELAM-1 of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

3 讨论

鼻咽癌主要采用以放疗为主的综合治疗，局部复发与远处转移是其治疗失败的主要原因。鼻咽癌的转移是一个非常复杂的过程，涉及多种基因及多条信号传导通路，包含了多种生物学行为，但具体机制尚未完全阐明。建立动物肿瘤模型是进行肿瘤病因学、预防和治疗研究中不可或缺的手段，良好的动物模型是进行后续实验的关键步骤，应具备稳定性高，易操作、易重复，且移植瘤的形态及生物学特性与人体肿瘤相似。包伟晶等［6］综述了多种鼻咽癌裸鼠模型建立的方法，其中采用CNE-2Z建立的皮下移植瘤模型成瘤率高，但其转移率低；采用5-8F细胞系建立的尾静脉移植瘤转移模型虽经血道可转移至肺、肝，但不发生淋巴结转移，且无法确定原发瘤位置。目前尚未见5-8F细胞系爪垫移植瘤转移模型。本研究将高成瘤、高转移的5-8F细胞接种于裸鼠爪垫构建裸鼠鼻咽癌转移模型，发现造模后1周左右16只裸鼠爪垫均成瘤，成瘤率为100.0%。约30 d后裸鼠腹股沟可触及肿大淋巴结，通过病理证实16只裸鼠中10只出现转移，其中7只仅淋巴结转移，1只仅腹盆腔转移，2只既发生淋巴结转移又出现腹盆腔转移，转移率为62.5%，HE染色观察细胞形态结构与人鼻咽癌细胞一致，说明本研究成功构建了高转移、稳定性好的裸鼠鼻咽癌转移模型。进一步绘制裸鼠移植瘤生长曲线，发现16只裸鼠潜伏期为7～14 d，原因可能是接种早期大部分癌细胞处于坏死吸收，造模后4～7周，随着新生肿瘤血管的出现，残存的癌细胞开始增殖并形成肿块，肿瘤体积增长呈指数形式，后期随代谢产物堆积、营养不足出现坏死及有丝分裂周期延长而逐渐减慢，最后进入平台期，其生长规律符合Gompertz函数［7］，再次印证本研究建立的鼻咽癌裸鼠转移模型具有良好的稳定性。此外，本研究发现转移组移植瘤增长速度较非转移组快，且两组差异具有统计学意义，但具体原因不明。

ELAM-1是细胞黏附分子家族中的一员，具有玉型跨膜蛋白特征，由589个氨基酸构成，其结构组成包括凝集素区、表皮生长因子区、4～9个短重复序列、单一的跨膜区和1个胞浆。ELAM-1所结合的配体sLex或sLea为糖蛋白或糖脂结构，它们互为同分异构体，大量存在于多种癌组织中。已有研究报道ELAM-1的表达程度与肺癌、结直肠癌、食管癌、胰腺癌等肿瘤的转移密切相关［8-13］。本团队张涛等［14］前期研究发现ELAM-1在46例人鼻咽癌组织中高表达，且转移组表达阳性率明显高于非转移组，提示ELAM-1可能促进鼻咽癌转移。邓玫等［15］亦得到类似结论。本研究成功建立鼻咽癌裸鼠转移模型后，进一步采用免疫组化法检测ELAM-1的表达，结果显示所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、转移淋巴结及远处转移瘤中ELAM-1表达均呈阳性，且转移组ELAM-1表达量明显高于非转移组，提示ELAM-1在鼻咽癌转移过程中起重要作用，其在鼻咽癌细胞表面的分布，可能使肿瘤细胞更易发生侵袭和转移。通常情况下，ELAM-1合成后以分泌颗粒的形式储存于内皮细胞的胞质内，在白细胞介素1、α肿瘤坏死因子和细菌脂多糖等因子刺激下，内皮细胞定向活化并释放ELAM-1，以共价键的形式与肿瘤细胞表面配体sLex或sLea在凝集素样区相互结合，从而介导肿瘤细胞的滚动、黏附，而该过程是诱发肿瘤转移的关键［16］。但本研究16只裸鼠解剖时间未设置明显梯度，未能进一步研究ELAM-1与肿瘤生长时间的关系，在后续实验中将扩大样本量并设置明显的时间梯度进一步研究。

综上所述，本研究通过爪垫注射成功构建了稳定性好、转移率高的鼻咽癌裸鼠转移模型，且ELAM-1在裸鼠鼻咽原发癌、转移癌中高表达，可能是鼻咽癌转移的重要分子标志物，为鼻咽癌及转移灶的监测、临床治疗以及患者预后评估等提供新的思路。