环境条件对蕲艾叶品质影响的研究＊

蒲 锐，万定荣＊＊，赵百孝，武 娟，史楠楠，黄璐琦，张梦娜

（1. 中南民族大学药学院 武汉 430074；2. 北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；3. 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 北京 100700）

艾叶是我国传统的中药材，也是世界上著名艾灸疗法的原材料，具有散寒、温经止血的功效[1]。湖北蕲春县所产的蕲艾叶为艾叶的道地药材，是国家地理标志保护产品。其挥发油、总黄酮及鞣质等活性物质[2-7]的平均含量均显著高于其它地区所产艾叶的平均含量。环境条件是影响药材品质的重要因素[8-11]，而蕲艾生长环境等因素对其有效物质含量和出绒率的影响研究未见报道。我们通过收集湖北省蕲春县不同地点、不同环境的土壤进行含水量、有机质含量及pH 值的测定，并收集了相应地点蕲艾叶样品，对其主要有效物质（挥发油、总黄酮、鞣质）含量及出绒率进行测定比较，还通过HPLC 谱图分析了不同样品中几种有机酸的含量变化，从而探讨了环境条件对蕲艾有效物质积累及出绒率的影响，以期为蕲艾的合理栽培并生产高品质蕲艾叶原材料提供参考。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，Chromeleon 色谱工作站，美国戴安公司）；BDS hypersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5µm，赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；UV-1800PC型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；AB256-S 型1/10 万电子分析天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司）；CP214 万分之一分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4 型水浴锅（金坛市科兴仪器厂）；挥发油提取器（武汉杰恒达工贸有限公司）；85-2数显恒温磁力搅拌器（金坛市科兴仪器厂）；PHS-3C 型pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌油浴锅（武汉科尔仪器设备有限公司）。

表1 湖北省不同地点与不同环境的蕲艾叶样品信息

1.2 试药与材料

磷钼钨酸试液按照2015 版《中国药典》四部通则8002下的方法进行配制；对照品芹菜素（批号111901-201603，纯度99.2%）、没食子酸（批号110831-201605，纯度90.8%）、绿原酸（批号110753-2011415，纯度96.2%），均购自中国食品药品检定研究院；对照品隐绿原酸（批号wkq18031901）、3,5-二咖啡酰奎宁酸（批号wkq18041207）、3,4-二咖啡酰奎宁酸（批号wkq18012408）、4, 5- 二 咖 啡 酰 奎 宁 酸（批 号wkq18050905）、异泽兰黄素（批号wkq16082105），均购自四川省维克奇生物科技有限公司，棕失车菊素（批号P06J9F63077）购自上海源叶生物科技有限公司，上述对照品的纯度均标示大于98.0%；重铬酸钾、硫酸亚铁、浓硫酸、甲醇和其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。蕲艾样品共21 份于2017 年5 月27 日采于湖北蕲春县不同地点与不同环境（表1），经万定荣教授鉴定，均为菊科植物艾Artemisia argyi Lévl. et Vant.的干燥叶。同时，采集了每份蕲艾（叶）样品所处地点的土样。

2 方法

2.1 土壤水分的测定

取各新鲜土壤样品约30 g，精密称定，参照《中华人民共和国国家环境保护标准》土壤干物质和水分的测定“重量法”（HJ 613—2011）规定的方法进行测定。

2.2 土壤pH值的测定

按照《中华人民共和国农业行业标准》“土壤pH的测定”（NY/T 1377—2007）规定的方法进行测定。

试样的制备：用四分法取适量风干土壤样品，剔除土壤以外的侵入体，再将土壤碾碎，过2 mm 孔径的试验筛，混匀，装入洁净土样袋中备用。

试样溶液的制备：取上述土样，约10.0 g，精密称定，置于50 mL 的高型烧杯中，加水25 mL，密封，用搅拌器剧烈搅拌5 min，静置2 h，即得。

分析步骤：取上述试样溶液，充分摇动后，依法用pH计进行测定。

2.3 土壤有机质的测定

准确称取通过0.25 mm 孔径试验筛的风干土样0.25 g（精确到0.000 1 g，称样量按规定根据预先测定有机质含量而定），按照《中华人民共和国农业行业标准》土壤检测第6 部分：土壤有机质的测定（NY/T1121.6—2006）项下方法进行测定。

2.4 挥发油含量测定

取各剪碎蕲艾叶样品（碎末直径1-2 mm，下同）约40.0 g，精密称定，参照2015版《中华人民共和国药典》挥发油测定法（中国药典第四部通则2204）进行测定，其中加入烧瓶中的水的体积为600 mL。

2.5 总黄酮含量测定

测定方法：测定方法通过本课题组实验而确定，其供试品溶液的制备、测定波长、测定方法均参阅课题组成员的相关文献[12]。方法学考察表明，该方法精密度、重复性及加样回收率均符合含量测定要求，供试品溶液配制后在24小时内测定结果稳定。

对照品溶液的制备：精密称取芹菜素对照品10.05 mg，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇适量使溶解，并定容至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.15、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL，分别置25 mL 量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，以70%甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法，在338 nm 处分别测定吸光度。以吸光度A 为纵坐标（Y），对照品溶液的浓度（µg·mL-1）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算得回归方程：Y =0.079 6X + 0.008 8（r=0.999 7），表明在0.598 2-15.951 3µg·mL-1范围内，芹菜素浓度与吸光度呈良好的线性关系。

样品含量测定：取上述蕲艾叶样品共21批，剪碎，分别取约1 g，精密称定，依法制备供试品溶液并进行测定。每份样品各制成2 份供试液，取平均测定值作为含量测定结果。

2.6 鞣质含量测定

取各剪碎样品约2 g，精密称定，按照2015 版中国药典第四部通则2202 项下的方法进行测定。其中标准曲线的制备照紫外-可见分光光度法，在760 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸的浓度（µg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程为Y=0.125 6X+0.038 7，r=0.999 8。结果表明在0.908-9.08 µg·mL-1范围内，没食子酸的浓度与吸光度呈良好线性关系。

2.7 出绒率检测

取样法：从蕲艾叶大样中抽取160.00 g 初始样品（除尽杂质异物及小枝梗的净重），通过四分法取样，最终获取10.00 g 试验样品用于出绒率检测。每一大样重复抽样检测两次，取平均出绒率作为检测结果。

检测方法：将10.00 g 试验样品用高速粉碎机（转速24 000 r·min-1）连续粉碎处理2 min后，置于20目分样筛中，加盖反复过筛，除尽粉末。取出细绒状的艾绒，称重，计算蕲艾绒所占百分比。取两份样品检测的平均出绒率作为检测结果。

方法学初步验证：以上述拟定的出绒率检测方法，经对产于湖北蕲春县的同一艾叶大样平行取样重复检测6 次，其各测定出绒率的相对标准差（RSD）为3.99%，表明拟定的检测方法重复性良好，能可靠用于蕲艾叶出绒率的检测。

2.8 样品HPLC谱图的比较

色谱条件：色谱柱为BDS Hypersil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（A：0-18 min、12%→19%，18-30 min、19%→23%，30- 43 min、23%→32%，43-54 min、32%→42%，54-60 min、42%→60%，60-70 min、60%→83%）；流速为0.8 mL·min-1；检测波长为360 nm；柱温为25 ℃；进样量为10µL。

对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、棕失车菊素、异泽兰黄素对照品各适量，置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，再精密量取1 mL，用甲醇稀释，即得分别含绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、棕失车菊素、异泽兰黄素35.0、25.0、50.0、40.0、40.0、38.0、40.0µg·min-1的对照品溶液。

供试品溶液的制备：取剪碎的各艾叶样品约0.50 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，加入70%甲醇溶液25 mL，称定重量，85℃水浴回流1 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置10 mL 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，用0.22µm 微孔滤膜滤过，即得。

3 结果与分析

3.1 土壤样品水分、pH、有机质测定结果

按照上述土壤水分、pH、有机质测定的方法，对湖北蕲春县21 批蕲艾（叶）样品所处地点的土壤样品进行检测，检测结果见表2。

表2 湖北蕲春县不同地点及环境土壤的水分含量、pH值、有机质含量检测结果

3.2 挥发油、总黄酮、鞣质含量及出绒率测定结果

按照上述样品中挥发油、总黄酮、鞣质含量测定的方法对21批蕲艾叶样品进行测定，测定结果见表3。

从检测结果分析，施复合化肥、日照长短和土壤水分含量对蕲艾有效物质含量有影响。其中李时珍医药集团院墙内的3份施化肥（含N、P、K的复合肥）与不施化肥的对照样品测定结果说明：施过化肥的蕲艾样品挥发油平均含量比未施化肥的高出17.6%，但总黄酮和鞣质的平均含量分别降低28.5%、30.5%，且出绒率平均降低9.2%。说明施用化肥尽管可略提高挥发油含量，但在整体上对蕲艾叶质量有显著的不良影响。蕲春县漕河镇独山村、张榜镇韩榜村、檀林镇雷冲村三个地点蕲艾叶样品的测定结果说明：日照不足的蕲艾叶样品挥发油的平均含量比日照充足的高出12.6%，但总黄酮和鞣质的平均含量均显著降低（分别降低23.5%、19.1%），且日照不足环境下的蕲艾样品出绒率整体较低，说明日照不足从总体上明显降低艾叶质量。另外通过蕲春县竹林湖基地、清水河基地、三江村三个地点水分含量相差显著的蕲艾叶样品的测定结果说明，土壤水分较少的蕲艾叶样品挥发油平均含量比水分充足的高出5.5%，但总黄酮和鞣质的平均含量均显著降低（分别降低21.4%、34.6%），说明水分不足在整体上对蕲艾叶质量有不良影响。

表3 湖北省不同地点、环境（含施化肥与否）蕲艾叶样品有效物质含量及出绒率测定结果

3.3 蕲艾叶品质—环境因素相关性及差异显著性分析

采用spss22.0 软件对蕲艾叶采样地点的土壤是否施肥、土壤水分是否充足及日照长短与相对应的蕲艾叶有效物质检测数据进行配对样本t 检验分析，结果表明：施肥（16、18、20号）与未施肥（17、19、21号）样品的挥发油、总黄酮、鞣质的含量均有显著性差异（P ＜0.05）；土壤水分充足（3、6、9号）与土壤水分较少（4、5、8 号）样品的总黄酮含量有显著性差异（P ＜0.05），土壤水分充足与土壤水分较少样品的挥发油、鞣质的含量也均有明显差异（P 均接近0.05）；全日照（10、12、14号）与日照时数较短（11、13、15 号）的样品中挥发油、总黄酮、鞣质的含量也有差异（P接近0.05）。

此外，采用spss22.0 软件（除去人为因素施化肥的影响），选取1-15 号样品对各采集点的土壤pH、有机质与相对应的活性物质含量检测数据进行相关性分析，结果表明，蕲艾叶总黄酮和鞣质的含量也受土壤pH 值的影响，在蕲春县酸性和偏酸性土壤pH 值范围内，总黄酮含量与pH 值呈一定的正相关，鞣质的含量与pH值呈显著的正相关（P小于0.05）。

3.4 HPLC谱图比较结果

将不同环境的蕲艾叶按2.8 项下方法制备供试品溶液，按照2.8 项下色谱条件进样检测分析，分别比较了施复合化肥（16、18、20 号）样品与不施复合化肥（17、19、21号）样品、日照时数较长（10、12、14号）样品与日照时数较短（11、13、15 号）样品、土壤水分较少（4、5、8 号）样品与土壤水分充足（3、6、9 号）样品的HPLC 谱图（图2，图3，图4）。结果表明，三批施复合化肥样品的色谱峰面积均低于未施肥样品（色谱峰的总面积平均降低24.5%），说明使用化肥在总体上降低了谱峰所代表的化学成分的总量，即降低了蕲艾叶的质量；三批日照时数较短样品的色谱峰面积也均低于时数较长的样品（色谱峰的总面积平均低27.8%），说明栽培于日照不充分的环境中将在整体上降低蕲艾叶的质量。三批土壤水分较少样品的色谱峰面积也均低于土壤水分较多的样品（色谱峰的总面积平均低28.4%），说明栽培于土壤水分不充足的环境中将在整体上降低蕲艾叶的质量。利用HPLC 谱图分析环境因素对艾叶相关成分量的影响，与上述对主要类型有效物质含量测定的结果一致。

图1 蕲艾叶和混合对照品HPLC谱图

图2 蕲艾叶样品（施肥与未施肥）的HPLC谱图

图3 蕲艾叶样品（不同日照时数）HPLC谱图

图4 蕲艾叶样品（土壤水分含量不同）HPLC谱图

通过与化学对照品相对保留时间的比对[13,14]，指认出蕲艾叶HPLC 谱图中7 个主要色谱峰（图1），分别为绿原酸(1)、隐绿原酸(2)、3,4-二咖啡酰奎宁酸(3)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(4)、4,5-二咖啡酰奎宁酸(5)、棕失车菊素(6)、异泽兰黄素(7)，其中前种为有机酸类，后2种为黄酮类。三批施复合化肥样品的5种有机酸色谱峰的总面积均显著低于未施化肥样品（色谱峰的总面积平均低36.4%），三批日照时数较短样品的5种有机酸色谱峰的总面积均明显低于日照时数较长的样品（色谱峰的总面积平均低19.5%），三批土壤水分较少样品的5种有机酸色谱峰总面积均显著低于土壤水分充足样品（色谱峰的总面积平均低26.7%）。说明施用复合有机化肥、植株日照时数及土壤水分含量不足，均对蕲艾叶的另一类活性物质有机酸的积累，也都会产生不利影响。

4 小结与讨论

产于湖北省蕲春县的蕲艾为国内外著名的中药艾叶的道地药材。本实验以采集于蕲春县不同地点、不同环境条件下的21批蕲艾样品，通过对几类有效物质的含量测定以及HPLC 指纹图谱相关成分（有机酸）量的分析，结果表明，在湖北省蕲春县蕲艾产地范围内，土壤水分、pH值、日照长短及施化肥与否对药用的蕲艾品质均有不同程度的影响。施用化肥（含N、P、K）和栽培于日照不足、土壤水分较少的环境中的蕲艾样品，分别与不施用化肥和栽培于日照、土壤水分充足环境中的样品相比，虽然均能提高蕲艾叶中挥发油含量，但却均显著降低总黄酮、鞣质和多种有机酸的含量，并往往明显降低出绒率；蕲艾叶鞣质和总黄酮的含量随着土壤pH 值（在酸性范围内）的升高而增加。这说明药用蕲艾的栽培应选择日照充分、土壤水分较充足及土壤偏酸性的环境条件。在蕲艾的种植过程中，不可避免地要使用肥料，虽然施用化肥可较大幅度提高其产量，只是若连年施用将导致土壤板结[15]，最终将降低蕲艾叶产量，甚至无法持续种植。此外，我们在早期的实验研究中，发现湖北省蕲春县竹林湖种植基地的蕲艾施用了厩肥和饼肥等有机肥，所产艾叶不仅产量高，其几类有效物质（挥发油、总黄酮、鞣质）的含量，与国内多产地的艾叶样品相比也是高的或最高的[12]，初步说明施用有机肥或农家肥对提高蕲艾叶的品质和产量都是有益的，值得进一步研究验证。

在药用方面，蕲艾叶还用来直接提取挥发油。如果仅仅考虑作为提取挥发油的原材料，由于酸性或偏酸性的土壤环境对蕲艾挥发油的含量高低没有明显影响，蕲艾的种植则可选择光照不够充分、适度干燥及排水良好的土壤环境，栽培中可通过施用有机肥或农家肥以提高产量，新的种植地块也可在第一年的春季施用少量化肥。