黄羽肉鸡饲料效率与粪便微生物多样性及丰度的相关性研究

宋颖超，白丽娟，任晓晗，杨翠香，张自富，陈思睿*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京100193；2.高邮市广游生态养禽场，江苏高邮 225600；3.信阳农林学院牧医工程学院，河南信阳 464000）

在黄羽肉鸡养殖中，饲料成本占养殖成本的60%～70%[1-2]，因此，提高饲料利用效率是降低养殖成本、提高收益的主要手段之一。国际上，饲料转化率（Feed Conversion Ratio，FCR）[1]和剩余采食量（Residual-Feed Intake，RFI）[1-3]是衡量饲料利用效率的2个有效指标。本试验据此2种指标，组建快大型黄羽肉鸡高、低饲料效率组。近年来，随着宏基因组学和宏基因组技术的发展，微生物在宿主饲料效率方面的重要性逐渐被揭示。有研究表明，拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门之间的互作关系可帮助宿主消化难以分解的多糖类物质[4]，从而提高机体对于糖类物质的消化和吸收。Turnbaugh等[5]指出，肠道微生物通过将难以消化的多糖发酵为单糖及短链脂肪酸从而调控脂肪沉积。Fetissov[6]指出，肠道微生物与宿主的饥饿和饱腹感有关，肠道微生物调节宿主摄食从而维持机体正常生长、发育的营养代谢。目前，国内外畜牧领域关于肠道微生物与宿主饲料效率的关系在猪[7]、牛[8]、鸡[9]等农业动物中均有报道，但肠道微生物与快大型黄羽肉鸡之间的互作关系未见报道。尽管粪便微生物不能代表整个宿主消化道内菌群丰度及分布概况，且个体间差异较大，但粪便微生物的一些变化规律仍可与宿主生理状态及健康状况有一定联系[4]，临床上粪便微生物被广泛用做机体健康状况的诊断依据。因此，本研究提取快大型黄羽肉鸡的粪便微生物DNA做分析，探究其与宿主饲料效率之间的互作关系，挖掘影响黄羽肉鸡饲料效率的作用菌群。

1 材料与方法

1.1 试验动物及方法 试验群体选自江苏兴牧农业有限公司270只1日龄快大型黄羽肉公鸡。试验群体处于相同的饲养环境下，单笼饲喂，饲养至63日龄，每5 d称量体重及耗料量，保证个体之间无接触。剔除因死亡而数据记录不全的个体后，利用剩余213只数据计算鸡群RFI和FCR，综合FCR和RFI分别选取高饲料效率组（High Feed Efficiency，HFE）和低饲料效率组（Low Feed Efficiency，LFE）各29只，采集其粪便样本，用Omega试剂盒（广州飞扬生物技术有限公司）提取粪便微生物DNA，保存于-20℃冰箱用于后续试验。

1.2 个体选择指标

其中，FI为5～63日龄采食量，BWG为5～63日龄体增重。

其中，FI为5～63日龄采食量，MBW为5～63日龄平均代谢体重，ADG为5～63日龄平均日增重，b0、b1和b2是对应的偏回归。

1.3 16 S rDNA V4区高通量测序 试验采取IlluminaHiseq 2500 PE250高通量测序平台，对粪便微生物DNA V4高变区进行测序，引物设计采用通用引物，具体为515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR 反 应 体 系50 μL：正向和反向引物各 10 μL(0.5 μmol/L)、2×Mster mix 25 μL、30 ng模板DNA。热循环反应：95℃初变性3 min，95℃变性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，反应进行30个循环，然后72℃延伸5 min。最后将目的区域DNA片段进行建库并在IlluminaHiseq 2500测序平台上进行文库测序，产生约240 bp片段。

1.4 统计分析 对原始数据进行过滤处理后获得Clean Tags，利用UPARSE在97%相似度下对Clean Tags进行聚类，得OTU（Operational Taxonomic Units）的代表序列，利用UCHIME（v4.2.40）[10]将PCR扩增产生的嵌合体从OTU代表序列中去除[16S 嵌合体数据库：gold database（v20110519）]， 使 用 usearch_global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，得到OTU代表序列后，通过RDP classifer（v2.2）软件将OTU代表序列与数据库有比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.8。

1.5 OTU统计及微生物分析 OTU Venn图、PCA（Principal-Component Analysis）主成分分析、NMDS （Non-metric-Multi-dimensional Scaling）、OTU Rank曲 线 均 用 R（v3.1.1）软件作图，用QIIME[11]软件将OTU代表序列进行比对，并根据比对序列，挑选每个属丰度最高的序列作为代表序列构建系统进化树。利用mothur（v1.31.2）软件进行Alpha多样性分析，通过QIIME（v1.80）进行Beta多样性分析。利用Metastats软件进行统计学分析，检验2组样品间微生物群落丰度的差异，并用FDR（False Discovery Rate）评估差异的显著性。

2 结 果

2.1 个体表型及测序数据 高、低饲料效率组个体的选择如图1所示，FCR和RFI都可以作为高、低饲料效率组的分组依据，个体选择结果是一致的。根据粪便微生物DNA 16S rDNA测序结果，本试验样本Tags总数为4 083 573，平均70 409.53条，OTU总数为17 632，平均304个，高低饲料效率两组黄羽肉鸡粪便微生物共有760条OTU，低饲料效率特有OTU（71）高于高饲料效率（56）黄羽肉鸡（图2）。PCA主成分分析及NMDS非度量多维尺度分析如图3、4所示，本试验群体在2个主要作用成分上无明显差别，且表现较高相似性。

图1 FCR和RFI双选择下个体分布

图2 高、低饲料效率组Venn图

图3 主成分分析图

图4 非度量多维尺度分析

图5 菌群相对丰度饼图

2.2 丰度差异 高、低饲料效率组在门、纲、目、科、属、种水平上，优势菌群的种类一致，但丰度有差异（图5）。在门水平上，厚壁菌门（HFE：74.05%，LFE：68.48%）、变形菌门（HFE：18.66%，LFE：23.91%）和蓝藻菌门（HFE：2.71%，LFE：2.43%）在高、低饲料效率组中丰度较高（P＞0.05）；柔壁菌门在高、低饲料效率组粪便微生物中差异显著（P＜0.05），分别占比1.37%和0.23%。在纲水平上，丰度较高的芽孢杆菌纲（HFE：43.72%，LFE：48.24%）、梭菌纲（HFE：29.43%，LFE：19.84%）、γ变形菌纲（HFE：18.48%，LFE：23.73%）在高、低饲料效率组中差异均不显著（P＞0.05）。在目水平上，相对丰度前三位的分别为乳杆菌目（HFE：34.93%，LFE：48.09%）、肠杆菌目（HFE：18.34%，LFE：23.67%）和梭菌目（HFE：29.42%，LFE：19.82%）， 且 3个 菌 目在2组水平上差异均不显著。在科水平上，相对丰度排名前三的分别为乳杆菌科（HFE：35.48%，LFE：41.94%）、肠杆菌科（HFE：18.43，LFE：23.69%）和 瘤 胃 菌 科（HFE：11.22%，LFE：11.50%）， 且差异均不显著。此外，梭菌科在丰度上排名第四，但是在高（7.84%）、低（1.81%）饲料效率组中差异极显著（P＜0.01）。在属水平上，乳酸菌属（HFE：35.37%，LFE：41.89%）、艾希氏杆菌属（HFE：18.03%，LFE：19.97%）、肠球菌属（HFE：7.41%，LFE：5.66%）差异均不显著。SMB53在属水平粪便微生物丰度水平排名仅次于肠球菌属，但其在高、低饲料效率组（HFE：7.14%，LFE：1.41%）粪便微生物丰度差异极显著（P＜0.01）。种水平，高、低饲料效率组粪便微生物中排名前三的分别为大肠杆菌（HFE：17.97%，LFE：19.90%）、盲肠肠球菌（HFE：7.38%，LFE：5.62%）和柔嫩梭菌（HFE：4.53%，LFE：5.82%），且差异均不显著。

2.3 微生物多样性

2.3.1 个体微生物多样性 个体微生物多样性采用Alpha多样性分析[11]来表示，具体用observed species指数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数以及Simpson指数表示物种丰富度和均匀度，前4项越高，最后1项越低，表示物种越丰富。高、低饲料效率组粪便微生物多样性对比用表1表示，其图形结果用图6表示。本次试验中，组内群体多样性及丰富度均较高，但高、低饲料效率组间的所有指数均无显著差异（P＞0.05）。

2.3.2 样品间微生物多样性 高、低饲料效率组黄羽肉鸡粪便微生物用Beta多样性表示，运用QIIME（v1.80）平衡各样本所得序列，根据计算平衡序列距离，得Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweightedUniFrac 用以表示样品间多样性。如图7～9示，本次试验58个个体粪便微生物样品间多样性并无明显差别，且高低饲料效率2组粪便微生物亲缘关系较近。

表1 Alpha组间多样性统计结果

图6 组间Alpha多样性盒型图

图7 Bray-curtis热图

图8 weighted unifrac热图

图 9 unweightedunifrac热图

3 讨 论

3.1 门水平差异菌群 微生物运用其快捷的消化代谢机制参与宿主饲料转化主要是机体的糖代谢过程，包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径和厌氧分解途径[13]。研究表明，厚壁菌门可分解葡聚糖[14-15]、肽聚糖[16]、糖原[17]等肠道内宿主无法消化的多糖类物质，将其分解为宿主可消化的小分子糖类，从而促进机体对营养物质的消化和吸收，进而提高饲料效率。拟杆菌门和柔壁菌门在高、低饲料效率组中差异显著，这3个粪便微生物中丰度相对较高的菌门在高饲料效率组中占比较高，这可能与该组个体较高饲料转化率有关。Kaoutari等[18]构建以厚壁菌门、拟杆菌门为主要丰度的微生物区系探究人体肠道微生物内碳水化合物活性酶的分布和丰度，结果示厚壁菌门和拟杆菌门微生物基因主要编码碳水化合物活性酶（CarboHydrate-active Enzymes，CAZyme），CAZyme主要分解碳水化合物，因此高饲料效率组中厚壁菌门、拟杆菌门以及柔壁菌门的丰度较高是造成其饲料转化率高于低组的主要原因。同时，黄羽肉鸡粪便微生物中厚壁菌门丰度最高，这与严伟[4]在矮小型褐壳蛋鸡粪便微生物中得出厚壁菌门是优势菌门的结果一致。因此，在鸡肠道微生物中，以厚壁菌门为优势菌门，厚壁菌门和拟杆菌门占主要丰度的微生物菌群组成是造成饲料效率高的主要原因之一，其中厚壁菌门和拟杆菌门在影响饲料效率方面起主要作用。

3.2 纲、目、科、属水平差异菌群 在纲水平，丰度较高的芽孢杆菌纲、梭状芽胞杆菌纲、拟杆菌纲及柔膜菌纲均属于3个菌门（厚壁菌门、拟杆菌门、柔壁菌门），其中芽孢杆菌纲和梭状芽胞杆菌纲属于厚壁菌门，拟杆菌纲属于拟杆菌门，柔膜菌纲属于柔壁菌门。柔壁菌门细菌无细胞壁，作为其唯一分支的柔膜菌纲自身多数生物合成功能退化，需依靠宿主完成自身核酸、氨基酸及脂肪酸生物合成[19]，因此，柔膜菌纲在高、低饲料效率组的差异及功能水平可代表柔壁菌门的差异及功能。Skennerton等[19]认为，柔膜菌纲细菌由于没有完整的三羧酸循环及氧化磷酸化，只能进行底物水平磷酸化产生ATP供其生长发育，柔壁菌纲在提高饲料效率方面的主要作用可能是参与宿主或其他细菌在生物合成过程中产生的高能磷酸化合物进行自身及宿主的生命活动，提高宿主代谢水平，促进营养物质转化。目水平的梭菌目在高饲料效率组中的丰度高于低饲料效率组，其科水平的梭菌科（梭菌科与肥胖有关[20]）、属水平的SMB53在高、低饲料效率组中均达到差异极显著水平，SMB53为梭菌科的一个属，目前其只有相关文献结果表述[21-22]，但无相关功能描述，其可能与肉鸡的饲料效率有关，因此SMB53在影响饲料效率方面的功能有待进一步探索。梭菌科为梭菌纲一个分支，梭菌纲隶属于厚壁菌门，厚壁菌门、梭菌科、SMB53均体现在高饲料效率组中，SMB53可能是影响快大型黄羽肉鸡饲料效率的重要菌属，且是微量的、高效的。属水平除SMB53外，还有24种菌属在高、低饲料效率组粪便微生物中差异极显著，其中17种菌属在低饲料效率组种的丰度极显著高于高饲料效率组，7种菌属在高饲料效率组中的丰度要极显著高于低饲料效率组；12种菌属达差异显著水平，其中，4种菌属在低饲料效率组显著高于高饲料效率组，5种菌属在高饲料效率组显著高于低饲料效率组，且这些差异极显著及差异显著的菌属在粪便微生物中的丰度均不高（丰度＜0.1%）。在低饲料效率组显著和极显著高于高饲料效率组的菌属中，有42.31% 来自变形菌门，其中63.64% 为α变形菌纲。这种差异分布与遗传背景相同的快大型黄羽肉鸡的饲料效率有关，且对宿主饲料效率的影响是微效的，粪便微生物在宿主体内的丰度和分布对宿主饲料效率的作用有待进一步发掘。

3.3 种水平差异菌群 本研究结果在种水平指出在分布微生物中丰度较高的3种细菌，即大肠埃希氏杆菌（LFE：17.97%，LFE：19.00%）、盲肠球菌（HFE：7.38%，LFE：5.62%）和粪肠球菌（HFE：4.23%，LFE：5.81%）。大肠埃希氏杆菌是肠道常见的菌群。Benevides-Matos等[23]研究发现，大肠艾希氏杆菌与婴幼儿腹泻有关。大肠艾希氏杆菌在低饲料效率组鸡只的较高丰度可能是影响个体对饲料效率转化的主要原因之一。至今对盲肠球菌生物学功能及生态学等了解甚少，其在饲料效率方面的作用还有待进一步挖掘。粪肠球菌可降低机体三酰基甘油、磷脂、胆固醇酯含量，使内脏脂肪组织中脂连素表达上调，皮下及内脏脂肪组织对胰岛素敏感性增加且炎症减少，增加肌肉质量[24]。因此，在种水平丰度较高的3种菌是影响黄羽肉鸡饲料效率的主效菌。种水平有10个存在差异菌种，其中4个菌种（Psychrobacter pulmonis、Pseudomonas viridif l ava、Clostridium perfringens、Lactobacillus agilis）差异达极显著水平，6个菌种（Mycoplasma hyorhinis、Roseomonas aerilata、Sphingopyxis alaskensis、Haemophilus parainfluenzae、Acinetobacter rhizosphaerae、Eubacterium dolichum）达差异显著水平，且该10个菌种在个体粪便微生物含量极微，在高饲料效率组中Eubacterium dolichum含量高于低饲料效率组61倍，其对机体得出作用尚未见报道，但推测其对于饲料消化吸收代谢有促进作用，从而导致菌种在含量上呈显著差异。其余9种显著差异菌群由于其含量极微，且含量过高易使机体产生病理反应，它们与机体的互作关系是微妙的，具体作用与合适菌群丰度有待进一步研究。

4 结 论

在相同的遗传背景与饲养条件下，高、低饲料效率组黄羽肉鸡的粪便微生物菌群优势菌群种类一致，但丰度存在差异，且该差异分布与饲料效率有关。厚壁菌门是影响饲料效率的优势菌门，厚壁菌门、拟杆菌门及柔壁菌门的相互作用在宿主饲料效率转化方面起到重要作用。厚壁菌门的梭杆菌纲、梭菌目、梭菌科中的SMB53可能是影响饲料效率的重要菌属。