固定化柚皮苷酶解转化制备普鲁宁

焦 超，李婧雅，李利君,2，杨秋明,2， 翁惠芬,3，肖安风,2,3

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.福建省海洋功能食品工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

普鲁宁是一种具有降低胆固醇、抗氧化及抗病毒等功效的黄酮苷类物质，在食品和药物方面有很好的应用前景[1-3]。但是，普鲁宁在自然界中的丰度较低，难以从生物组织中提取制备。因此，研究人员将目光转向了可以制备普鲁宁的柚皮苷(4′-5,7′一三羟基二氢黄酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)，它是一类二氢黄酮类化合物，是枳实、化橘红等几味中药的主要有效成分[4]。柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下可发生特异性水解反应脱掉α-L-鼠李糖，生成普鲁宁。

相关研究表明[5-6]，以柚皮苷为底物，利用α-L-鼠李糖苷酶生物转化是制备普鲁宁的有效手段。但是由于柚皮苷是一种极性化合物，不但难溶于油脂[7]，而且在水溶液中以游离状态存在时溶解性也很差。虽然柚皮苷易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，但是使用有机溶剂代替水溶液进行酶解反应时，又会破坏酶的蛋白质结构，酶的活性和稳定性受到影响。因此，研究增大酶与柚皮苷的接触，提高柚皮苷作为酶解底物的利用度是非常有必要的。

酶催化固相底物反应是一种将底物固定在固相载体上，然后溶解在溶液中的酶扩散到底物附近与之接触，发生反应的反应形式[8]。根据此反应机制，利用可以特异性吸附黄酮类化合物的大孔吸附树脂，将柚皮苷固定在树脂载体上，之后游离酶扩散到固定化的柚皮苷附近而与之发生反应，可以很好改善底物溶解性。有关酶催化固相底物反应的应用研究很多，Ulijn等[9]报道了一种蛋白酶催化的多肽合成，将底物氨基酸固定在PEGA1900载体上，而后在水溶液中用嗜热菌蛋白酶将氨基酸直接合成二肽，产量高达99%。Wang等[10]利用可控多孔玻璃(controlled pore glass，CPG)固定核苷，制备出含有二硫键单元的肽-寡核苷酸偶联物。本文选择了几种大孔吸附树脂对柚皮苷进行固定化，选择出满足条件的最优树脂，对酶催化固相底物反应进行初步研究，反应条件温和，选择性高，产物容易分离，符合绿色化学的发展方向，为柚皮苷的生物转化提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 重组α-L-鼠李糖苷酶的制备

将含有重组质粒pPIC9K-rha的毕赤酵母GS115菌株进行活化，活化后的菌液转接至BMGY液体培养基中继续培养，收集A600≥3.0的菌体，根据毕胜[11]细胞重悬方法重悬后，置于摇床在30 ℃、220 r/min条件下诱导表达重组α-L-鼠李糖苷酶，发酵72 h后，室温3500 r/min离心10 min，收集上清液。

1.2 α-L-鼠李糖苷酶活力的测定

采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[12-13]，以柚皮苷为底物进行酶活力的测定，测定的反应体系为：950 μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.0)加入1 mL 300 mg/L的底物和50 μL的酶液，50 ℃反应15 min后，过0.22 μm滤膜后利用HPLC测定反应液中柚皮苷和普鲁宁的含量。在50 ℃、pH=5.0的条件下反应1 min，消耗1 μg柚皮苷所需的α-L-鼠李糖苷酶的量定义为一个α-L-鼠李糖苷酶活力单位。

1.3 大孔吸附树脂的预处理

具体流程如下：漂浮筛选→95%(体积分数)乙醇泡24 h→湿法上柱→95%(体积分数)乙醇洗→蒸馏水洗→2%(质量分数)盐酸泡3 h→蒸馏水洗→2%(质量分数)氢氧化钠泡3 h→蒸馏水洗。

1.4 柚皮苷的固定化

分别将0.5 g湿重的5种大孔吸附树脂加入到50 mL 0.2% (g/mL)的柚皮苷溶液中，置于50 ℃的恒温振荡水浴中充分振荡固定，至上清液中柚皮苷浓度不再发生变化为止。

1.5 柚皮苷吸附量的测定

HPLC法检测树脂吸附前后柚皮苷溶液中柚皮苷浓度的变化，并根据下式计算出树脂对柚皮苷的饱和吸附量：树脂对柚皮苷的饱和吸附量(mg/g)=(C0-C1)×V/m,式中：C0、C1分别表示柚皮苷溶液在树脂吸附前后的浓度(g/L)；V表示柚皮苷溶液的体积(mL)；m表示树脂的用量(g，湿重)。

1.6 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解过程分析

取0.4 g预处理好的树脂加入到0.002 g/mL的柚皮苷溶液中，缓冲液pH=5.0，置于50 ℃水浴中恒温振荡固定，同时加入α-L-鼠李糖苷酶酶液，反应体系的总体积为20 mL。在振速为120 r/min下酶催化固定化柚皮苷反应360 min，每隔一段时间取样一次，沸水灭活10 min后，冷却至室温，测定反应体系中还原糖、柚皮苷及普鲁宁的含量随时间的变化情况。在此基础上，通过柚皮苷酶解过程中还原糖的生成量，来考察酶用量、底物浓度、pH值、温度、振荡速度及金属离子等对固定化柚皮苷酶解作用的影响。

1.7 柚皮苷转化率的计算

柚皮苷转化率/%=[还原糖生成量/182.11×580.53]/柚皮苷总质量×100，其中，182.11为鼠李糖相对分子质量，580.53为柚皮苷相对分子质量。

1.8 α-L-鼠李糖苷酶水解固定柚皮苷的动力学分析

以固定化柚皮苷为底物，α-L-鼠李糖苷酶粗酶液为催化剂，在不同的底物浓度下，于60 ℃，120 r/min振荡器中反应360 min，每60 min取样一次，沸水水浴15 min灭活后测定酶解液中还原糖的生成量，制作α-L-鼠李糖苷酶水解固定化柚皮苷的动力学模型并计算参数Km和Vmax[14-15]。

2 结果与分析

2.1 固定化柚皮苷树脂载体的选择

选择5种国产大孔吸附树脂作为固定化柚皮苷的载体，通过研究树脂对柚皮苷的吸附量，以及各树脂固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶催化作用下的酶解反应效果，得出最佳的树脂载体。采用HPLC法测定5种树脂对柚皮苷的吸附量，其结果如图1所示。

由图1可见，5种树脂载体对柚皮苷饱和吸附量大小为D4020>D101-1>AB-8>D101>DM130。而从图2中可以明显看出，反应2 h各树脂固定化柚皮苷的酶解作用差异不大，但是2 h后D101-1树脂固定化柚皮苷后酶解作用明显强于其他树脂，与图1中5种树脂对柚皮苷的饱和吸附量结果结合可得出，D101-1树脂对柚皮苷的吸附效果及酶解反应效果最好。因此综合树脂载体对柚皮苷的吸附量以及酶解催化反应效果，选择D101-1大孔吸附树脂做后续试验。

2.2 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解过程分析

在20 mL反应体系中，固定其他条件不变，改变α-L-鼠李糖苷酶的加酶量，催化柚皮苷进行酶解反应6 h，测定反应液中还原糖生成量，计算柚皮苷的转化率随时间的变化情况，其结果如图3a所示。从图3a中可以看出，随着加酶量的增加，柚皮苷转化率明显增加，反应初速率也相应增大。这是由于增加了加酶量使反应液中浓度一定的底物在单位体积、单位时间内接触酶的机率增大，所以催化反应初速率会增大，转化率也增加。当加酶量增大到30 U/mL，继续增加加酶量，柚皮苷的转化率变化不大，反应到3 h后基本一致，对酶解反应的促进作用不大。因此，选择加酶量为30 U/mL。然而与游离酶催化柚皮苷的酶解转化相比，将柚皮苷固定化后酶解速率有所减慢，所用酶量增加而且反应时间变长，这可能是由于树脂载体的存在阻碍了酶与底物的接触所致。

从图3b中可以看出,其他反应条件固定，随着底物浓度增大，酶解反应达到平衡所需时间延长，还原糖生成量变大，但是增加量越来越少。当柚皮苷浓度较低时，酶相对过量，酶反应很快达到平衡。而当柚皮苷浓度较高时，酶与底物接触机会增大，酶反应初速率有一定加快，还原糖的生成量相应增加，但是反应达到平衡的时间也会增加。反应生成的还原糖对反应有一定的抑制作用，因此随着底物浓度的增大，还原糖的增加量越来越少。柚皮苷的转化率计算时是以底物浓度为分母，所以底物浓度变大，分母不变时所得转化率会小。因此，要综合考虑还原糖生成量和柚皮苷转化率来确定最适底物浓度。当底物质量浓度为2.4 g/L时，柚皮苷转化率最高，底物质量浓度大于2.4 g/L时，转化率反而减小，所以最后选择底物质量浓度为2.4 g/L。

pH值对酶活力有很大的影响，过酸或过碱等不适宜的条件都会使酶活力降低甚至丧失，只有在最适pH值的条件下才可以显现出其最大活力。因此，考察pH值对柚皮苷酶解作用的影响十分有必要。改变反应体系中缓冲液的pH值，考察柚皮苷的转化率随时间的变化曲线，其变化趋势如图4a所示。pH值对酶反应的初始速率、还原糖生成量以及柚皮苷转化率都有一定影响。由图4a可知，pH=3.5～4.5，转化率差别不大，但是相对其他pH值范围的转化率要高，pH值继续增大，转化率反而减小，说明该酶适应酸性环境，在pH=4时酶解反应稳定增加且效果相对较好，与游离酶催化柚皮苷水解反应的最适pH值一致，因此在酶解反应中选择缓冲液pH=4.0。

酶催化反应的速率与反应温度有很大的关系，在最适温度条件下酶才可以表现出最大酶活力，但生物酶作为一种蛋白质，当温度超过其可接受范围时，易变性而失活。由图4b可知，随着温度升高，酶解反应初速率相应增大，柚皮苷转化率也随之增高。当温度达到60 ℃时酶反应的初速率最大，柚皮苷转化率最高，但是当温度达到70 ℃后0.5 h内酶已基本失活，酶蛋白的变性是随时间的延长而累加的。所以选择酶反应的最适温度为60 ℃。

固定其他反应条件不变，分别加入浓度为5 mmol/L的不同金属离子，酶解反应1 h后取样测定金属离子对酶解反应的影响，所得结果如图5所示。从图5中可以看出，金属离子可参与催化反应，与空白组相比较，Mn2+、Fe2+和Co2+对酶活力有促进作用，其中5 mmol/L的Fe2+促进作用最强；Na+、Ca2+、K+、Mg2+和Zn2+对酶活力影响不大；Fe3+和Cu2+对酶活力有明显的抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最强。

进一步考察不同浓度的Mn2+和Fe2+对酶反应的促进作用，结果见图6。由图6a可知，与空白组相比较，低浓度的Mn2+对酶解反应的影响不大，反应初速率以及反应初期柚皮苷转化率都几乎相同，到反应后期显示出一些促进作用，但是作用不大。高浓度的Mn2+对酶解反应具有很强的促进作用，Mn2+可能作为生物转化反应的促进剂。由图6b可知，低浓度的Fe2+对酶解反应几乎没有促进作用，当Fe2+浓度为0.1 ，0.5，1 mmol/L时初始反应速率和柚皮苷转化率都没有明显的变化，当Fe2+浓度达到10 mmol/L时，初始反应速率很快，但是后来由于反应温度高，在反应液中的Fe2+被氧化，颜色变成棕色，柚皮苷转化率不再增加，说明高浓度的Fe2+对酶解反应有极强的促进作用。

2.3 最优工艺验证和1 L放大试验

根据前面的试验结果，在加酶量为30 U/mL、pH=4.0、温度为60 ℃、振荡速率为80 r/min、底物质量浓度为2.4 g/L的条件下进行最优工艺验证和1 L放大试验，结果见图7。由图7可以看出，采用最优条件进行酶解反应时，初速率大于未优化前，柚皮苷转化率在420 min时可达到78%，最终产物生成量也有所提高。但是，与游离柚皮苷的酶解反应相比，柚皮苷的转化率有所下降，而且酶解反应达到平衡所用的时间大大延长。这可能是由于柚皮苷与载体树脂结合后形成了空间位阻，在一定程度上阻止了柚皮苷与酶分子的接触反应。反应体系放大到1 L后，随着反应时间的延长，还原糖生成量不断增加，柚皮苷转化率也不断增大，酶解反应420 min后基本达到平衡，柚皮苷转化率约为75%，这与20 mL反应体系的实验结果基本一致。

2.4 酶解反应动力学

由图8可知，反应初速率-底物浓度的Lineweaver-Burk双倒数拟合方程为y=38.929x+1.9074，计算酶解反应的Km值和最大反应速率Vmax值，得到：Km=5.12 g/L,Vmax= 0.013 g/(L·min)。而游离柚皮苷酶解反应动力学的米氏常数Km=0.588 g/L，Vmax=0.011 g/(L·min)。对比固定化柚皮苷前后的Km值可以看出，柚皮苷经固定化后Km增大很多，说明底物固定化以后，由于树脂载体内部的空间位阻和扩散效应造成酶与底物的亲和性降低，反应初速率下降。

2.5 TLC和HPLC法分析反应产物

在最优工艺验证试验时，固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下进行酶法转化，可以得到反应产物鼠李糖和普鲁宁。分别在反应前和反应后取样检测验证其中的反应产物，薄层层析结果可直观反映出酶解反应的反应产物，结果如图9所示。对照薄层层析图中柚皮苷、普鲁宁以及鼠李糖的颜色和位置可以看出，反应前反应液中只有柚皮苷，加入α-L-鼠李糖苷酶反应一段时间后，柚皮苷逐渐水解转化成普鲁宁和鼠李糖，反应7 h达到平衡后柚皮苷转化率为80%，反应液中产物为普鲁宁和鼠李糖，还有些残余的柚皮苷。说明该重组的α-L-鼠李糖苷酶与柚皮苷特异性反应的产物中不会含有柚皮素，省去了用柚苷酶水解柚皮苷生成柚皮素的干扰，使产物普鲁宁分离纯化变得简单。

在最优工艺验证试验时，固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下进行酶法转化，可以得到反应产物鼠李糖和普鲁宁。分别在反应前、反应中间和反应后取样留待检测验证其中的反应产物，HPLC结果如图10所示。由图10可见，加酶液前反应液中只含有柚皮苷，加入酶液反应后，柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下逐渐反应转化成了普鲁宁，随着反应时间的延长，反应液中柚皮苷量逐渐减少，普鲁宁的生成量逐渐增多，反应7 h后反应基本达到平衡，反应液中含有产物普鲁宁和少量未转化完全的柚皮苷。该检测方法检测不出还原糖的生成，但是可以确定反应产物中没有柚皮素的生成。

3 结论

对α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解条件进行考察，在所考察的5种大孔吸附树脂中，最适合用作载体的树脂为D101-1大孔吸附树脂。α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解的最适反应条件为：酶用量30 U/mL，反应温度60 ℃，pH=4.0，底物质量浓度2.4 g/L，振荡速率80 r/min。在此条件下反应420 min，柚皮苷转化率达到78%。高浓度的Mn2+、Fe2+对酶解反应有极强的促进作用。通过最优工艺验证试验及1 L放大试验证明了该优化工艺具有良好的重现性。最后利用TLC法和HPLC验证得出，反应完全后可得到纯的普鲁宁。