日本鳗鲡抗菌蛋白BPI基因的克隆、鉴定与表达

王 佩，段明珠，黄 贝，熊 静，梁 英，黄文树,2,3

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021;3.福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建 厦门 361005)

0 引言

抗菌肽(antimicrobial peptides)又称宿主防御肽，是生物体天然免疫系统的重要成分，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类广谱抗微生物活性的多肽[1-3]。杀菌/渗透性增强蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI) 是一类重要的抗菌肽，是Weiss等[4]1975年从兔子中性粒细胞中首次分离出来的，是一种可迅速杀死大肠杆菌(Escherichiacoli)的多肽。1977年，Weiss等[5]从人类的中性粒细胞中也分离得到了该抗菌肽，其 Isoelectric Point(pI)值为9.8，分子质量为58～60 ku，当pH值达到7.0时，其杀菌和增强渗透性活性均最大，可杀死革兰氏阴性菌，如大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonellaspp.)，因此，命名为杀菌/渗透性增强蛋白。哺乳动物BPI是一类胞外蛋白质[6]，其N端富含精氨酸和赖氨酸，以及两个位置保守的半胱氨酸。精氨酸和赖氨酸均为阳离子氨基酸，可与含有带负电荷的LPS结合，从而杀菌，或结合/中和内毒素[7]。其C端和N端中间有脯氨酸富集中心连接，该区域可促进BPI 分子与LPS 结合，并介导BPI-LPS 复合物向特定宿主细胞转运[8-9]。BPI被学者称为未来的“超级抗生素”[10]。

除BPI外，哺乳动物的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)也可识别LPS，二者均属于脂质转移和脂多糖结合蛋白家族成员[11]。人类的LBP和BPI序列相似性高达45%，其晶体结构相似[12-13]。LBP是一种胞浆蛋白质，与细菌脂多糖特别是类脂A高度亲和[14]。在LPS刺激的炎症反应中LBP表达量增多，且可调节LPS颗粒使其与吞噬细胞表面的CD14结合[14]。

在哺乳动物中BPI和LBP的基因序列和功能明显不同，但是，在硬骨鱼类中目前尚无法明确区分BPI和LBP[15-16]， 因此，常以BPI/LBP表示。迄今为止，已在多种硬骨鱼中克隆和鉴定了BPI/LBP基因，如虹鳟(Onchorhynchusmykiss)[17]、锦鲤(Cyprinuscarpio)[18]、大西洋鳕(Gadusmorhua)[19]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[20]、香鱼(Plecoglossusaltivelisaltivelis)[15]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[21]、条石鲷(Oplegnathusfasciatus)[22]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[16]和团头鲂(Megalobramaamblycephala)[23]等。与哺乳动物BPI基因主要在中性粒细胞和各种黏膜上皮细胞中表达不同，鱼类BPI/LBP基因的组织表达模式较多样。如鲤科鱼类：草鱼BPI在鳃中表达量最高，其次是头肾和中肾[16]；锦鲤BPI基因在肝脏和脾脏中表达量最高[18]；团头鲂BPI/LBP基因在肾脏中表达量最高[23]。又如石鲷科鱼类：条石鲷BPI-1在脾脏和肝脏中表达量最高，BPI-2在肾脏中表达量最高[22]。此外，外源刺激物刺激后，鱼类BPI转录表达变化规律也不同。如受LPS刺激3 h后，锦鲤肝脏和头肾中的BPI均微弱上调[18]，而受LPS刺激2 h后，团头鲂脾脏中BPI/LBP上调达到最高值[23]。

日本鳗鲡(Anguillajaponica)是我国重要的养殖鱼类[24]。然而，细菌性疾病一直困扰着鳗鲡养殖业发展。迄今为止，关于鳗鲡的抗细菌免疫应答的研究较为缺乏。BPI是重要的抗细菌免疫因子，是鱼类天然免疫系统的重要组成部分，目前未见鳗鲡属BPI的相关研究。基于此，本研究运用SMARTerTMRACE技术，从日本鳗鲡中克隆、鉴定BPI基因序列，并进一步利用Real-time PCR技术，研究在正常养殖和人工免疫物刺激下，BPI基因在日本鳗鲡体内表达量变化的规律，以期为阐析鳗鲡BPI/LBP基因的分类、命名及其结构功能等提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

日本鳗鲡((203±53)g)，购于福建省集美大学水产养殖基地。于水温(28±2)℃暂养1周后，采集日本鳗鲡血液、鳃、心脏、肝脏、胃、肠、脾脏、头肾、中肾、鳔、性腺和皮肤等组织/器官用于试验。

免疫刺激试验： 腹腔注射，设PBS对照组、LPS刺激组(0.01 mg/g，Sigma)、Poly I:C刺激组(0.01 mg/g，Sigma)、迟缓爱德华氏菌刺激组(2×105cfu/g)，在注射后8 h、16 h、24 h和72 h采样。每组每个时间点随机取鳗鲡8尾。

1.2 BPI基因cDNA序列的克隆

将约100 mg日本鳗鲡肝脏组织用Trizol®Rreagent试剂盒提取其总RNA，具体操作参考相关研究[25]。用琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法(NanoDrop2000，美国Thermo)检测所提取总RNA的完整性和纯度，即RNA 的28 S和18 S条带清晰且D260/D280为1.8～2.0时，方可用于下一步实验。随后，总RNA经RNase-free DNase I(New England Biolabs Inc，美国)处理，反转录(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech，美国)获得第一链模板。

通过分析已制备的日本鳗鲡肝脏和肾脏cDNA文库，获得BPI基因的EST序列，设计引物(见表1)，进行巢式PCR扩增，获得BPI基因的5′和3′末端cDNA序列，进一步设计引物，再经PCR扩增，验证其全长cDNA序列。

1.3 BPI基因组序列的扩增

取日本鳗鲡的肌肉，参照MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒(TaKaRa，日本)说明书，提取日本鳗鲡基因组DNA。根据已经获得的基因全长cDNA 序列设计特异性引物(见表1)，扩增BPI的基因组DNA。

1.4 Real-time PCR

取4 μg健康日本鳗鲡组织的总RNA，经DNA酶处理及反转录(GoScripTMReverse Transcription System，Promega，美国)用以制备Real-time PCR模板，用RNAase free water稀释一定倍数后保存、备用。

以β-actin为内参基因，在 LightCycler 480 II实时定量PCR仪上进行实时检测与分析。qPCR反应体系如下：2× LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix 10.0 μL，稀释后的cDNA模板4.0 μL，正、反向引物 (10 μmol·L-1)各0.5 μL，PCR-Grade water 5.0 μL。反应条件：95 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，40个循环。荧光信号采集温度为81℃。反应结束后分析产物的溶解曲线，判断其特异性。以β-actin作为内参基因，梯度稀释已知拷贝数的AJBPI和β-actin质粒样品及组织/器官样品分别进行PCR扩增，绘制标准曲线进而计算各基因的扩增效率。

1.5 生物信息学分析

利用NCBI网站中的Blast进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；通过ExPASy的翻译工具获得BPI的氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)，再用ExPASy预测BPI氨基酸的分子量和pI值(http://web.expasy.org/compute_pi/)；用SignalP 4.1 Server程序分析信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用Pfam程序分析BPI的结构域(http://pfam.xfam.org/)；利用DNAman软件进行氨基酸序列的多重比对；应用MEAG5.0软件，采用邻位相接法(NJ法)构建系统发育树。

1.6 数据统计分析

用Excel和Spss18.0软件进行数据计算，用单因素变量方差分析法 (ANOVA)分析LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后样品间的表达量差异，利用 Dunnettt-Test (2-sided) 进行多重比对。所有数据均用平均值±标准误差 (SEM) 的方式表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。利用GraphPad.Prism.v5.0软件进行作图。

表1 引物序列

说明：直下划线部分位于前一个外显子，加粗波浪线的部分位于后一个外显子

Notes:Nucleotides sequence underlined is located in the former exon，that with wavy line is located in the latter exon

2 结果

2.1 日本鳗鲡AJBPI基因序列分析

从日本鳗鲡的肝脏和肾脏cDNA文库中筛选到两条BPI的EST序列，通过RACE、PCR克隆和序列拼接，获得日本鳗鲡两条BPI的cDNA序列，分别命名为AJBPI-1和AJBPI-2。AJBPI-1 cDNA全长1617 bp，包括5′UTR 207 bp，开放阅读框(ORF) 1278 bp(编码425个氨基酸残基)，3′UTR 132 bp(见图1)，预测其前体肽分子质量为46.26 ku，pI值为8.58。AJBPI-2 cDNA全长1911 bp，包括5′UTR 93 bp，开放阅读框(ORF)1422 bp(编码473个氨基酸残基)，3′UTR 396 bp(见图2)，预测其前体肽分子质量为51.74 ku，pI值为10.11。通过Phyre2对抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2二级结构预测，结果表明二者主要由β-折叠构成，其含量分别高达53%和48%，该结构有利于AJBPI抗菌肽构象的稳定；其次为α-螺旋，其含量分别为21%和26%。通过SWISS-MODEL预测，发现抗菌肽AJBPI-1和AJBPI-2的三级结构相似，即它们均有“桶状结构单元”，该桶状结构单元由N-和C-末端氨基酸残基中心的β-折叠连接(见图3)。

通过对两种AJBPI的N端氨基酸残基分析可知，AJBPI-1含精氨酸和赖氨酸数量分别为4和8，少于AJBPI-2(12和35)(见图1、2和表 2)。

表2 鱼类BPI的序列信息

物种Species登录号Aaccessionno.基因Gene类型TypeN端赖氨酸个数The number oflysines atN-terminalN端精氨酸个数The number ofarginines atN-terminalpI值Isoelectricpoint与AJBPI-1的相似性或一致性/%Similaritywith AJBPI-1与AJBPI-2的相似性或一致性/%Similariwith AJBPI-2日本鳗鲡Anguilla japonica—BPI-1I488.58100/10044.70/32.70大西洋鲑Salmo salarACI33182.1BPII745.4856.47/44.4750.10/36.78条石鲷Oplegnathus fasciatusBAM21037.1BPII1044.6556.00/44.4749.47/35.94大黄鱼Larimichthys croceaABO32254.1BPII1145.1351.29/40.0046.82/34.11日本鳗鲡Anguilla japonica—BPI-2II201510.1144.70/32.70100/100团头鲂Megalobrama amblycephalaAIT76553.1BPI/LBPII1648.8548.47/33.8873.78/64.40斑点叉尾Ictaluru spunctatusAAX20011.1BPI/LBPII1778.1948.7/35.5273.99/63.84锦鲤Cyprinus carpioBAC56095.1BPI/LBPII1958.8250.35/34.3574.84/65.11牙鲆Paralichthys olivaceusACV74252.1BPI/LBPII1769.5950.35/36.0073.78/64.27虹鳟Oncorhynchus mykissBAB91244.1BPI/LBP-2II1969.3450.11/36.2376.53/67.65虹鳟Oncorhynchus mykissBAB91243.1BPI/LBP-1II1499.0748.70/35.0577.58/68.71香鱼Plecoglossus altivelis altivelisBAH11125.1BPI/LBPII19159.6752.00/36.2377.91/69.21胡瓜鱼Osmerus mordaxACO09816.1BPIII1279.6151.29/35.5279.14/70.00条石鲷Oplegnathus fasciatusBAM21038.1BPI/LBPII231510.1849.88/35.2976.95/66.80大西洋鳕Gadus morhuaAAM52335.1BPI/LBP-1II181210.0249.41/34.1168.28/57.50大西洋鳕 Gadus morhuaAAM52336.1BPI/LBP-2II181210.0549.17/33.8868.07/57.29

从两栖类、硬骨鱼类及哺乳动物中选取代表种的BPI序列(GenBank登录号见表3)，进行多重比对，结果显示：所有物种BPI都具有保守的LPS结合结构域和一对位置固定的二硫键，以及脯氨酸富集中心结构域。序列相似性比对结果显示，AJBPI-1序列与大西洋鲑相似性最高(56.47%)，其次为条石鲷(56.0%)；AJBPI-2序列与胡瓜鱼相似性最高(79.14%)，其次为香鱼(77.91% )(见表2)。利用MEAG4.0软件构建NJ系统进化树(Jones Taylor Thornton model,JTT模型)，系统进化树的拓扑结构显示：哺乳动物聚为一大支，硬骨鱼类聚为另一大支。其中硬骨鱼类又分为两小支：AJBPI-1与大西洋鲑、条石鲷和大黄鱼的阴离子BPI基因聚为一支；AJBPI-2与虹鳟等阳离子BPI基因聚为一支(见图4)。

表3 其他物种的登录号

2.2 AJBPI-1和AJBPI-2基因在不同组织中的分布

利用Real-time方法分析AJBPI-1和AJBPI-2在正常鳗鲡不同组织中的表达规律。结果显示：二者在日本鳗鲡肝脏、肠、皮肤、心脏、血液、胃、头肾、中肾、脾脏、鳃等组织/器官表达中均有转录表达，尤其是在肝脏、中肾、脾脏、头肾、皮肤、血液中表达量较高。AJBPI-1在肝脏中转录表达量最高，是β-actin的0.075倍；而AJBPI-2，在头肾和中肾中表达量较高，是β-actin的0.44倍。中肾、头肾和血液中的AJBPI-2极显著高于AJBPI-1(P<0.001)，而肝脏中的AJBPI-1却极显著高于AJBPI-2(P<0.01)(见图5)。

2.3 免疫刺激后AJBPI-1和AJBPI-2的基因表达变化

为了研究不同刺激物刺激后对AJBPI-1和AJBPI-2基因表达情况的影响，本实验用LPS、Poly I:C和E.tarda分别刺激日本鳗鲡。结果显示：

脾脏中，经Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-1的表达量均迅速达到最高值，分别为PBS对照的4.0倍和3.3倍，刺激后16 h，AJBPI-2的表达量均显著上调(P<0.05)，分别为PBS对照组的2.3倍和1.7倍。经LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2的表达水平无显著变化(P>0.05)(见图6)。

鳃中，经LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后，AJBPI-2的表达量均有上调。其中，LPS和Poly I:C刺激后24 h，AJBPI-2表达量最高，分别为PBS对照组的2.5倍和17.0倍；E.tarda刺激后18 h，AJBPI-2表达量最高，为PBS对照组的7.0倍。而该三种刺激物刺激后，AJBPI-1的表达量均无显著变化(P>0.05)(见图6)。

中肾中，经LPS和Poly I:C刺激后16 h，AJBPI-1和AJBPI-2的表达量均显著上调(P<0.05)。其中，LPS刺激后，AJBPI-1和AJBPI-2分别为PBS对照组的3.0倍和2.0倍；而Poly I:C刺激后，AJBPI-1 和AJBPI-2均为PBS对照组的2.2倍。然而，E.tarda刺激后，中肾中AJBPI-2的表达量无显著变化(P>0.05)(见图6)。

3 讨论

BPI是一类含有LPS结合结构域和脯氨酸富集区的阳离子抗菌肽。它通过LPS结合结构域与革兰氏阴性菌的脂多糖发生结合[26]，从而发挥抗菌作用。

鱼类I型BPI主要在中性粒细胞和上皮细胞中表达。如条石鲷BPI-1基因在肝脏、脾脏中高表达[22]，大黄鱼BPI基因在肝脏、头肾、心脏中高表达[21]。本研究的AJBPI-1在所检测的各个组织中均有表达，且在肝脏、头肾和脾脏中高表达。这表明日本鳗鲡BPI-1基因的组织分布与上述鱼类BPI基因的组织分布相似。异源性抗原物质如LPS、病毒和细菌刺激可显著诱导鱼类BPI基因的表达。如E.tarda和真鲷虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)诱导后，条石鲷BPI-1基因在头肾中表达量显著上调[22]。受溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和诺卡氏菌(Nocardiaseriolae)刺激后，大黄鱼头肾、脾脏、肠道、肾脏、鳃和肌肉中BPI基因的表达量显著上调[21]。本研究发现，用LPS、Poly I:C和E.tarda分别刺激日本鳗鲡中肾、脾脏和鳃时，中肾中AJBPI-1的表达量均有显著上调；在Poly I:C和E.tarda刺激下脾脏中AJBPI-1的表达量具有显著性变化，而鳃中AJBPI-1的表达量均无显著变化。根据以上结果可知，BPI-1主要在脾脏、肾脏等造血器官中高表达。

综上所述，本研究从日本鳗鲡中克隆、鉴定了两类AJBPI基因。AJBPI在所检测的组织中均有不同程度的表达，用LPS、Poly I:C和E.tarda分别刺激时日本鳗鲡中的肾、鳃和脾脏中的AJBPI均有不同响应。该研究结果显示AJBPI可能参与日本鳗鲡的抗细菌和抗病毒免疫，而且它将为鱼类的BPI/LBP基因的命名、分类及其功能分析等提供一定的理论依据。