有机酸和醇对以浸米水为原料发酵细菌纤维素的影响

曹艳，夏其乐，陈剑兵，单之初，陆胜民*

(1.浙江省农业科学院食品科学研究所农业农村部果品采后处理重点实验室 浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室浙江 杭州 310021； 2.浙江塔牌绍兴酒有限公司，浙江 绍兴 312000)

细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是由微生物产生的一类纤维素的统称，由葡萄糖分子以β-1，4-糖苷键聚合而成[1]，其区别于植物纤维的主要特点是具有高持水力、高结晶度、高弹性模量、良好的生物相容性和机械性能等特性[2-3]。由于BC不含热量、咀嚼性好，目前主要用作食品配料(又称为纳塔)添加在罐头、果冻、冰淇淋、火腿肠等食品中[2, 4]。目前，生产BC的主要原料是自然发酵的椰子水，产量为10～12 g·L-1(干质量)。但我国椰子年产量只占全世界的0.04%[5]，生产原料不足、生产成本较高制约了我国BC产业的发展。此外，BC也可作为新型材料基质用于医药、化工、造纸等领域[6]，使得BC需求量逐年增加，而国内目前所消费的BC几乎全部靠进口。

浸米水是黄酒酿造过程中的主要副产物之一。我国黄酒年产量200万t左右，而生产1 t黄酒一般会产生大约0.65 t浸米水，浸米水量大而集中。目前浸米水主要通过沉降处理、上清经曝气处理后排放[7-8]。在浸米过程中，稻米中的淀粉、蛋白质、维生素等营养物质被浸出，大量乳酸菌和酵母菌在其中繁殖并分解这些营养物质，使得浸米水中含有丰富的糖类、蛋白质、有机酸和氨基酸等营养物质[9]。因此，浸米水如果能被合理利用，即可成为回收利用的资源，而如果被当作废物弃之就会严重污染环境，最终对黄酒产业产生不利影响。

目前，利用其他原料代替椰子水生产BC的研究报道也越来越多，其中以含糖/氮量较高的农副产品加工副产物居多[10-13]。而浸米水外观与自然发酵的椰子水类似，呈浅黄色或浅棕色，pH在2.0～4.0，闻起来有酸味，且都经过微生物发酵，其中除了碳源、氮源、氨基酸等营养物质外，还含有大量可以被木醋杆菌利用的有机酸和醇类[9, 14]。王志国等[15-17]的研究结果表明，一些小分子有机酸和醇类可促进BC合成。因此，本研究以浸米水为原料，考察了添加不同有机酸和醇类对BC产量的影响，确定了影响以浸米水为原料发酵BC的主要物质因素，为促进国内BC产业发展和实现浸米水提质增效提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

木醋杆菌Gluconacetobacterxylinus，购于微生物菌种保藏中心，保存于-80 ℃冰箱；浸米水取自浙江塔牌绍兴酒有限公司，浸米水经沉降过滤后，上清液用于配制BC发酵培养基。

UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；WYA-Z自动阿贝折射仪，上海仪电科学仪器有限公司；雷磁PHS-25台式pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；高压蒸汽灭菌锅，北京发恩科贸有限公司；生化培养箱，上海博迅实业有限公司；超低温冰箱，三洋电机国际贸易有限公司。

1.2 培养基及发酵条件

菌种活化培养基。葡萄糖10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，碳酸钙5 g·L-1，琼脂粉17 g·L-1，以蒸馏水补足1 L，pH值自然，121 ℃灭菌15 min，冷却到50～55 ℃后，倾倒至培养皿中备用。

种子培养基。参考HS培养基[18]。蔗糖20 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.7 g·L-1，柠檬酸1.15 g·L-1，用蒸馏水补足1 L，pH值自然，115 ℃灭菌15 min。100 mL种子培养基装于250 mL烧杯，30 ℃静置培养3～4 d。

浸米水基础发酵培养基。蔗糖30 g·L-1，酵母浸提物5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，柠檬酸1 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3 g·L-1，FeSO40.05 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，以浸米水补足1 L，pH值自然，115 ℃灭菌15 min。120 mL发酵培养基量装于300 mL烧杯中，接种量3%～5%，30 ℃静置培养10 d。接种前向基础发酵培养基中添加不同种类、浓度的有机酸和醇，考察其对BC产量的影响。

1.3 测定方法

1.3.1 pH值和可溶性固形物含量

pH值测定用雷磁PHS-25台式pH计测定；可溶性固形物含量(°Brix)用WYA-Z自动阿贝折射仪测定[19]。

1.3.2 菌体浓度

向不同发酵时期的发酵培养基中添加100 U·g-1纤维素酶，于45 ℃、100 r·min-1水浴加热6 h，待BC完全水解后，于600 nm处测定BC水解液和培养基混合液的吸光度(D600)[20]。

1.3.3 BC产量

将发酵所得BC取出后，用水冲洗几次，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol·L-1的NaOH溶液，80 ℃煮沸20 min，去除BC膜中的菌体和残留培养基，然后用蒸馏水多次冲洗，直至用pH试纸轻压膜测pH值为中性。105 ℃干燥至恒质量，BC产量用单位体积培养基所得BC干质量计(g·L-1)。

1.4 数据处理及分析

每个处理均重复测定3次，结果所示数据均为3次平行试验数据的平均值±标准偏差，采用Excel 2010和SPSS 20.0对数据进行处理和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 添加不同有机酸和醇类对BC发酵的影响

在浸米水基础发酵培养基中添加0.5 g·L-1不同有机酸和醇条件下，BC产量如图1所示。添加的有机酸和醇均是糖类在微生物体内的代谢产物，因此，它们可直接作为碳源或通过糖异生途径被木醋杆菌利用。从图中可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油对BC合成有显著促进作用，且添加乳酸、乙酸或乙醇条件下BC产量大幅提高；苹果酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸和酒石酸抑制BC合成；丙酮酸和山梨醇对BC合成基本没有影响。由此可以看出，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可作为以浸米水为原料发酵BC的增效因子。

A，对照；B，乳酸；C，乙酸；D，丙酮酸；E，苹果酸；F，琥珀酸；G，α-酮戊二酸；H，草酰乙酸；I，酒石酸；J，乙醇；K，甘油；L，山梨醇。柱间无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)图1 添加不同有机酸和醇对以浸米水为原料发酵生产BC的影响

选择具有代表性的处理组(添加乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、乙醇和甘油)，考察其发酵过程中可溶性固形物含量和菌体浓度变化，如图2所示。从图中可以看出，添加丙酮酸条件下，菌体生长和可溶性固形物含量下降趋势均与对照相差不大，由此可看出，丙酮酸没有对菌体生长和代谢活性产生影响，最终BC产量也与对照相当。添加乳酸、乙酸或乙醇条件下，最大菌体浓度和可溶性固形物含量下降速率均比对照显著提高，且提高幅度较大。添加琥珀酸和甘油条件下，最大菌体浓度和可溶性固形物下降速率比对照略高，BC产量提高幅度虽然较小，但与对照相比仍有显著升高。添加α-酮戊二酸条件下，最大菌体浓度和可溶性固形物下降速率均显著低于对照，表明菌体生长及其代谢活性受到抑制，导致BC合成量下降。

图2 添加不同有机酸和醇对菌体浓度和可溶性固形物含量的影响

BC合成需要消耗大量能量，乳酸、乙酸和乙醇作为糖酵解途径的代谢产物，它们可通过氧化生成丙酮酸，参与胞内代谢并产生能量，较多的能量可以促进BC的合成[16, 21-22]。琥珀酸作为三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环的中间代谢产物，额外添加可保证TCA循环的持续正常运行，使胞内能量水平维持在相对稳定的水平，有利于BC合成[23]。甘油可通过糖异生途径生成丙酮酸，参与BC合成，且不生成葡萄糖酸，胞内底物代谢大部分转向BC合成[24]。此外，甘油还可作为菌体在逆境中的保护剂，有利于维持菌体较高的代谢活力，有利于BC合成。丙酮酸、α-酮戊二酸、苹果酸、草酰乙酸和酒石酸是微生物代谢的中间产物，其胞内含量可能已经能够维持正常代谢，额外添加反而会扰乱正常的胞内代谢，进而对木醋杆菌生长和BC合成产生不利影响。综上所述，乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油可促进菌体内部能量代谢或维持较高的菌体活力，进而促进BC大量合成。

2.2 不同浓度增效因子对BC产量的影响

在浸米水基础培养基中分别添加不同有机酸类增效因子(乳酸、乙酸和琥珀酸)条件下，BC产量如图3所示。从图中可以看出，随着有机酸浓度的增加，BC产量呈先增加后略微下降的趋势，当乳酸、乙酸和琥珀酸含量分别在0.6、2.0、1.5 g·L-1时，BC产量最高，且添加乳酸和乙酸条件下BC产量提高幅度高于添加琥珀酸。由此可以看出，乳酸和乙酸比琥珀酸更容易被木醋杆菌利用。Naritomi等[21]和Yang等[22]的研究均表明，乙酸和乳酸不是作为BC合成的底物，而是仅参与能量代谢，为BC合成和维持菌体代谢活性提供能量。琥珀酸作为TCA循环的中间代谢产物，虽然也可被菌体利用，但其在胞内的含量可能已经能够维持代谢平衡，因此，BC产量没有随着其添加量的增加而显著增加。

图3 浸米水培养基中添加不同浓度有机酸增效因子对BC产量的影响

在浸米水基础培养基中添加醇类增效因子(乙醇和甘油)条件下，BC的产量如图4所示。乙醇和甘油均可以作为碳源被木醋杆菌利用，但乙醇可被直接作为底物利用，而甘油则需要通过复杂的糖异生途径才能参与到BC合成途径中[25]。因此，虽然甘油可以作为底物用于BC合成，但有蔗糖存在时并不会作为优先碳源使用。此外，Yunoki等[17]的研究表明，乙醇不作为木醋杆菌合成BC的底物，其进入胞内后首先被氧化成乙酸、参与能量代谢，促进葡萄糖的聚合，提高了葡萄糖合成BC的效率，进而促进BC合成。因此，添加乙醇条件下BC合成量显著高于添加甘油条件下。

图4 浸米水培养基中添加不同浓度醇类增效因子对BC产量的影响

在浸米水基础培养基中将乳酸、乙酸、琥珀酸、乙醇和甘油按其最适量添加后，BC最终产量为8.4 g·L-1，虽然低于以椰子水为原料生产BC的水平(11.2 g·L-1)(图5)，但生产原料更经济，因此，仍具有一定的工业应用前景。

图5 浸米水培养基中添加混合增效因子对BC产量的影响

3 小结

本研究通过考察浸米水培养基中添加不同小分子有机酸和醇类对BC产量的影响，明确了对以浸米水为原料发酵BC具有促进作用的增效因子及其最适添加量，即乳酸0.6 g·L-1、乙酸2.0 g·L-1、乙醇20.0 g·L-1、琥珀酸 1.5 g·L-1和甘油2.0 g·L-1。将增效因子按其最适添加量混合加入浸米水培养基中，BC产量比对照提高3.59倍。浸米水是黄酒产业的主要副产物之一，利用浸米水生产BC，可大幅降低黄酒厂超标污水的排放量，且在不增加投入昂贵设备的前提下，实现浸米水提质增效的目的。此外，BC生产原料范围扩大，可大幅提高BC产量以满足其需求的上涨，促进我国BC产业发展。