UPLC波长切换法同时测定西红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量

田 园,夏梅玲,吴 佳,钱 勇,杨 洲

(上海诗丹德标准技术服务有限公司,上海201314)

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪；Waters ACQUITY UPLC®HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8μm)色谱柱(沃特世科技有限公司)；Empower 3分析软件；BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

西红花样品于2017年11月采自于中国上海崇明岛庙镇西红花种植基地,经本公司杨洲博士鉴定为鸢尾科植物番红花(CrocussativusL.)的干燥柱头,保存于上海诗丹德标准技术服务有限公司。

对照品：西红花苷-Ⅰ(批号：5231)、西红花苷-Ⅱ(批号：6053)、苦番红花素(批号：4060)均由上海诗丹德标准技术服务有限公司提供,纯度均在98%以上。

乙腈为色谱纯(Merck,Darmstadt,Germany),纯水为屈臣氏饮用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司),无水乙醇为分析纯(中国医药集团上海化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8μm),柱前连接Waters在线过滤器；流动相：A相为纯水,B相为乙腈；流动相梯度为：0～10 min,10%～25%B,10～20min,25%～50%B；柱温：25℃；进样量：2μL；流速：0.4m L/min,检测波长：254 nm、440 nm。

2.2 对照品溶液制备

取西红花苷-Ⅰ对照品、西红花苷-Ⅱ对照品和苦番红花素对照品适量,精密称定,置于棕色容量瓶中,加稀乙醇分别制成每1m L含西红花苷-Ⅰ30μg、西红花苷-Ⅱ12μg和苦番红花素18μg的混合溶液,即得。

2.3 供试品溶液制备

取西红花粉末(过三号筛)约10 mg,精密称定,置于50 m L棕色量瓶中,加稀乙醇适量,置于冰浴中超声处理30 min,放至室温,加稀乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

3 结果

3.1 专属性实验

分别精密吸取空白稀乙醇溶液、供试品溶液和对照品溶液各2μL,注入超高效液相色谱仪,按照“2.1”项下色谱条件进行测定,结果供试品溶液中的待测成分与混合对照品溶液中的色谱峰相对应,空白稀乙醇溶液在相应出峰位置无干扰(见图1)。由此可以说明,该分析方法的专属性良好。

有一熟人，平时交往不多，见面只是三言两语，不咸不淡，但仅仅只是三言两语都似乎飘忽不定，令人捉摸不透，不知何意，我直觉此人有点“阴”。某一日有人欲加我为QQ好友，观其头像乃是此人，看其Q名竟为“邻术”——不管其本意如何，仅从字面上理解就令我不寒而栗：一个以邻为壑、与邻谋“术”之人——敢推心置腹、以诚相待吗？我毫不犹豫地忽略了这个请求。

图1 西红花含量测定UPLC色谱

3.2 线性关系考察

分别精密称定一定量的西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素对照品于棕色量瓶中,加适量稀乙醇溶解定容,配制成混合对照品备用液。其中,混合对照品备用液中各对照品的浓度分别为西红花苷-Ⅰ48μg/m L、西红花苷-Ⅱ28.8μg/m L、苦番红花素60μg/m L。

取上述混合对照品备用液加稀乙醇进行梯度稀释,稀释成7个浓度梯度的溶液作为混合对照品溶液,各吸取2 μL混合对照品溶液注入超高效液相色谱仪,按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以浓度(μg/m L)(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程,如表1所示。

表1 线性关系试验结果

3.3 精密度试验

3.3.1 不同日期精密度试验 在不同工作日,按照“2.3”项下供试品制备方法分别制备3份供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定西红花各指标性成分的含量。结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD分别为0.97%、4.76%、3.98%,表明该方法的中间精密度良好。

3.3.2 不同人员精密度试验 由3位实验操作者,按照“2.3”项下供试品制备方法分别制备3份供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定西红花各指标性成分的含量。结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD分别为1.91%、1.83%、2.21%,表明该方法的中间精密度良好。

3.3.3 不同仪器精密度试验 按照“2.3”项下供试品制备方法分别制备3份供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件在不同仪器上测定西红花各指标性成分的含量。结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD分别为2.25%、0.77%、0.86%,表明仪器具有良好的精密度。

通过对不同日期、不同人员、不同仪器的精密度考察试验,结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD均小于5%,表明该方法的精密度良好。

3.4 重复性试验

按照“2.3”项下供试品制备方法制备6份供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件依次测定西红花各指标性成分的含量,计算其RSD。结果显示,西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD分别为1.26%、0.98%、1.85%,表明该方法重复性良好。

3.5 加样回收率试验

取已知各指标成分含量的供试品粉末适量,精密称定,于棕色容量瓶中,分别精密加入相对应量的西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素对照品,加入适量稀乙醇,按照“2.3”项下供试品制备方法进行后续步骤。取制备液作为加样回收样品试液,按照按照“2.1”项下色谱条件进行测定,计算西红花各指标性成分的回收率及RSD,结果见表2。

3.6 稳定性试验

取西红花供试品粉末适量,按照“2.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液,4℃放置。分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24 h、48 h、96 h注入超高效液相色谱仪,按照“2.1”项下色谱条件依次测定西红花各指标性成分的含量,计算其RSD。结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量的RSD分别为1.71%、1.27%、2.85%,表明西红花各指标性成分在4℃下96 h内稳定性良好。

表2 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素加样回收率试验结果

3.7 样品含量测定

取21批不同产地来源的西红花药材,按照“2.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件测定西红花各指标性成分的含量,结果见表3。

4 讨论

4.1 测定波长选择

采用PDA检测器于210～500nm波长范围内对西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素对照品溶液进行紫外扫描。结果显示,苦番红花素在254nm处有最大吸收,西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ在440 nm处有最大吸收[15-18]。由于西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的最大吸收波长不同,难以在同时兼顾到所有测定成分的某单一波长处进行检测。因此,本实验采用UPLC波长切换法同时测定西红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的含量。选择0～6min时在254nm波长下检测苦番红花素；在6～20 min时在440 nm波长下检测红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ。

4.2 提取时间选择

通过考察不同超声提取时间(15 min、20 min、30 min、40 min)对西红花各指标性成分含量的影响,发现当提取时间为30min时,西红花各指标性成分的含量不会再随超声提取时间的增长而增加,表明样品已基本提取完全,因此选择30 min为最佳提取时间。

4.3 流动相选择

通过考察不同流动相比例(乙腈比例变化±10%)对西红花各指标性成分含量的影响,结果表明流动相(乙腈)比例在一定范围内有微小变动时对该方法几乎没有影响。

4.4 柱温选择

通过考察不同柱温(23℃、25℃、27℃)对西红花各指标性成分含量的影响,结果表明柱温在一定范围内有微小变动时对该方法基本没有影响,本研究选择25℃作为含量测定时的柱温。

4.5 流速选择

通过考察不同流速(0.35 m L/min、0.40 m L/min、0.45 m L/min)对西红花各指标性成分含量的影响,结果表明,不同流速对样品的保留时间和分离度具有明显影响,当流速为0.4 m L/min时,西红花各指标性成分的分离度最大,因此本研究流速选择0.4 m L/min。

4.6 含量测定分析

通过对21批不同产地来源西红花各指标性成分进行含量测定,实验结果显示,各批西红花中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量之和均超过2015版药典中不得小于10%的标准,均符合药典要求。不同来源的西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量之和及苦番红花素的含量差异显著,国内来源(如上海、河北、浙江、安徽等地)的西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量之和及苦番红花素的含量稍高于国外来源(如伊朗、巴基斯坦等地)的西红花；以上海和浙江产的西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量之和及苦番红花素的含量最高,其原因可能与西红花产地、采收时间及加工储存方式等因素有关,具体原因有待进一步研究。

表3 西红花指标成分含量测定结果 (%)

本文采用UPLC波长切换法同时测定不同产地西红花药材中苦番红花素、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量,初步认为,该方法在操作上简便快捷、专属性良好、重复性好、精密度高且易于在生产、流通和使用环节中普遍应用。该方法在《中国药典》测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量的基础上,增加苦番红花素的含量测定,能够更全面体现西红花中主要成分的含量,可为西红花质量控制提供更加精确量化的依据,也为其生产流通中的质量监控提供了一定的科学参考。