纳豆激酶体外溶栓作用研究

许晓双,常 珊,戴东升

(江苏理工学院 生物信息与医药工程研究所,江苏 常州213000)

血栓性疾病是血栓形成和血栓栓塞2种病理过程所引起的疾病。血栓性疾病严重威胁人类的生命健康,其发病率高居各种疾病之首,是当代医学研究的重点和热点之一[1-2],因此溶栓药物的开发也成为了热门研究项目。目前溶栓药物分为3类[3-4]：第一类是链激酶(SK)和尿激酶(UK),溶栓效果较好且价格便宜,但容易引起颅内出血等副作用；第二类是组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)和乙酞化纤溶酶原-链激酶激活剂复合物,溶栓效果比第一类更好但在体内持续时间较短,需大量用药；第三类是受关注的天然溶栓剂,比如蚓激酶、纳豆激酶等,溶栓效果好且副作用小,已成为最具潜力的溶栓药物。

纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆菌(Bacillus natto)发酵纳豆得到溶栓作用强的碱性丝氨酸蛋白酶,具有成本低、半衰期长、可口服、选择性较高等优点。为了深入探究纳豆激酶的体外溶栓作用,本实验通过天然界筛选的菌种发酵提取的纳豆激酶,研究不同浓度的纳豆激酶对小鼠体外溶栓作用,从而得到溶栓效果好且不溶血的最佳浓度的纳豆激酶。以期为纳豆激酶深入研究溶栓作用机制奠定基础,并为纳豆激酶在临床的安全应用提供理论依据。

1 材料与试药

6周以上健康小鼠6只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。纳豆激酶由本实验室从市售纳豆中分离并筛选获得的纳豆枯草芽孢杆菌,经广东省微生物分析检测中心鉴定为枯草芽孢杆菌(报告编号：粤微检2012ZD0175),固态培养并分离纯化获得[5]。采用纤维蛋白平板法[5]检测溶栓活性方法对多批次纯化样本进行检测,并选取两个样本：NK-1,平板溶栓活性检测为6 472 U/m L；NK-2,平板溶栓活性检测为9 427 U/m L,进行体外溶栓实验。尿激酶注射液购自北京金赛药业,其余试剂均为国产试剂。

2 方法

2.1 纳豆激酶样品配制

将纳豆激酶样品NK-1、NK-2分别用生理盐水倍比稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25和15.63 U/m L,尿激酶为10.000 U/m L,各取上述样品1m L于玻璃试管中备用。空白对照为PBS。

2.2 纳豆激酶体外溶栓实验

将6只小鼠分别摘眼球取血于2 m L离心管中,室温放置1 h使血液凝固。小鼠血凝固后取出血块,制备血凝块16块,分别称重后同时放入相应的样品试管中。随后将玻璃试管放入37℃恒温水浴中并于0 min,2 h、7h、18 h观察血块溶解情况,并在显微镜下观察溶液中血细胞状态。反应7 h后取出各试管中未完全溶解的血凝块,用吸水纸将水分吸干后进行称重。

溶解率(%)=(原始重量-反应后重量)/原始重量×100%。

3 结果

3.1 0～7h不同浓度纳豆激酶的体外溶栓效果

不同浓度的纳豆激酶(NK-1、NK-2)对小鼠体外血凝块的溶解时间与溶解率见表1。由表1可见：①随着NK-1与NK-2稀释倍数的增加,其对血凝块的溶解时间逐渐增加,溶解率逐渐下降,但均快于尿激酶组和空白对照组；②NK-1-1000、NK-2-1000、NK-2-500在7h内能完全溶解血凝块；③250、500、1 000 U/m L的NK-1与NK-2对血凝块的溶解作用依次增强,且NK-2比NK-1的溶解时间短。

不同浓度纳豆激酶(NK-1、NK-2)对小鼠体外血凝块的溶解率趋势见图1。由图1可见：①随着NK-1、NK-2的稀释倍数增加,其对血凝块的溶解率逐渐减小；②15.63、31.25、62.5 U/m L的NK-1、NK-2对血凝块的溶解率相差不大,62.5～125 U/m L之间NK-2溶解率高于NK-1,125～250 U/m L之间NK-1高于NK-2,且125～250 U/m L之间NK-1与NK-2溶解率上升最快；③500～1 000 U/m L

NK-1与NK-2溶解率相差不大,基本完全溶解。

表1 不同浓度的纳豆激酶对小鼠体外血凝块的溶解效果

图1 不同浓度的纳豆激酶对小鼠体外血凝块的溶解率趋势

3.2 2～18 h不同浓度纳豆激酶的体外溶栓效果

不同浓度的纳豆激酶(NK-1、NK-2)在2 h和18 h时对小鼠体外血凝块的溶解效果见图2。由图2可见：①反应2h时,各试管中均可见未溶解凝血块,但NK组整体比尿激酶组与空白对照组的未溶解凝血块小；②反应18 h时,250、500、1

000 U/m L的NK-1与NK-2均完全溶解血凝块,其他组仍可见未溶解血凝块；③500、1 000 U/m L的NK-1与NK-2和尿激酶组的试管颜色呈红褐色,其他试管颜色还是较澄清,证明高浓度的NK和尿激酶可能对血红细胞有一定的破坏作用,其他组则破坏作用较小,说明250 U/m L以下的NK溶血现象不明显。

图3为125、250、500、1 000 U/m L的NK-1与NK-2在反应18h时在显微镜下观察的红细胞状态。由图3可见,与对照组UK-1000相比,不同浓度的NK-1与NK-2均有完整的血细胞可见,因此NK对血细胞破坏力较小,同时也佐证了250 U/m L以下的NK溶血现象不明显。

4 讨论

图2 不同浓度的纳豆激酶对小鼠体外血凝块的溶解效果(A：2h,B：18h)

图3 反应18h时不同浓度的纳豆激酶处理的血凝块血细胞状态

纳豆激酶是食品微生物来源的纤溶酶,是具有安全性好、成本低、口服有效等优点的新一代理想的预防和治疗栓塞的新型药物[6-7]。本实验通过天然界筛选的菌种发酵提取纳豆激酶样品NK-1与NK-2来研究不同浓度的纳豆激酶对小鼠体外溶栓的效果,结果显示2个NK-1与NK-2的实验平行性良好,500及1 000 U/m L纳豆激酶在7h内能完全溶解0.12 g左右的小鼠体外血凝块,125、250、500、1 000 U/m L的纳豆激酶溶解血凝块作用依次增强,其中125～250 U/m L纳豆激酶体外溶栓效果较好且溶血作用不明显,500～1 000 U/m L的纳豆激酶可能存在溶血作用,这可为纳豆激酶新型药物的开发提供理论依据。Sumi等[8]通过人体实验表明口服200g纳豆或2粒纳豆激酶肠溶胶囊(650 mg/粒)可以明显迅速降解纤维蛋白,从而增加血浆的纤溶活性；Cesarone等[9]评价高危受试者在长途航空旅行中口服溶栓剂150mg Pinokinase(一种含有纳豆激酶和利尿剂的混合物),可明显降低深静脉血栓和肢体水肿的发生；Suzuki等[10]证明每只大鼠口服含约50～100 U NK的纳豆提取物可以通过血栓溶解活性,抑制血管壁血栓形成而减少内膜增厚。以上研究说明NK在动物及人体实验中均被证实具有溶栓作用,但并没有明确具体浓度的NK用量能够起到更好的溶栓作用。因此,本文得到的125～250 U/m L NK体外溶栓效果较好,且溶血作用不明显的结果将为NK以后的动物及临床研究提供实验基础,并且为临床安全用药提供一定的理论依据。