高效液相色谱-蒸发光散射法测定黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量

陆 丹，赵懿清 ，高秋芳 ，郭卫东，邹济高

（1.江苏省无锡市第三人民医院，江苏 无锡 214000； 2.江苏省无锡济民可信山禾药业股份有限公司，江苏 无锡 214000）

黄氏响声含片为复方制剂，由薄荷、浙贝母、连翘、蝉蜕、胖大海、酒大黄、川芎、儿茶、桔梗、诃子肉、甘草、薄荷脑等药材组方，可疏风清热、化痰散结、利咽开音。方中浙贝母为君药，可解毒散结消痈[1]，其主要成分为贝母素甲（浙贝母碱）和贝母素乙（去氢浙贝母碱）[2]。本研究中采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法测定黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙的含量，为该制剂的质量控制奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括OpenLab工作站（美国Agilent公司）；ALLTECH 3300型蒸发光散射检测器（美国奥泰科技<中国>有限公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W）。

1.2 试药

黄氏响声含片（无锡济民可信山禾药业股份有限 公 司，批号分别为 171112，171121，171124，171204，171206，171207，180201，180204，180301，180303，180401，180403，180405，规格为每片 0.6 g）；贝母素甲对照品（批号为110750-201612，纯度为96.2%）、贝母素乙对照品（批号为110751-201712，纯度为97.7%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -水（65 ∶35，V/V，含0.035% 二乙胺）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；ELSD参数：漂移管温度为70℃，载气流速为1.4 L/min。

2.2 溶液制备

取贝母素甲和贝母素乙对照品各适量，精密称定，置容量瓶中，加流动相溶解并定容，制成贝母素甲和贝母素乙质量浓度分别为0.515 0 g/L和0.503 1 g/L的对照品贮备液，取适量，制得贝母素甲和贝母素乙质量浓度分别为0.506 4 g/L和0.503 7 g/L的混合对照品溶液。取样品适量，捣碎，研细，过4号筛，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入浓氨水-乙醇（1∶2，V/V）10 mL，密塞，浸泡 30 min，加乙醚-三氯甲烷-乙醇（50 ∶16 ∶5，V/V/V）混合溶液 25 mL，超声处理 30 min（控制水温低于30℃），滤过，滤渣用适量乙醚-三氯甲烷 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）洗涤 3次，合并滤液和洗液，60℃水浴挥干，残渣用流动相2 mL溶解，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方和工艺制备缺浙贝母的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2项下3种溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。结果理论板数按贝母素甲、贝母素乙峰计均不低于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好，保留时间分别为6.273 min和7.957 min，对称因子分别为0.82和0.84。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密量取混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，4.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制得系列对照品溶液，精密量取20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（μg/mL）的自然对数值（X）为横坐标、峰面积的自然对数值（Y）为纵坐标进行线性回归，得贝母素甲和贝母素乙回归方程分别为Y甲=1.4647X甲-0.1089（r=0.9998，n=5），Y乙=1.453 6X乙-0.016 0（r=0.999 9，n=5）。结果表明，贝母素甲和贝母素乙质量浓度线性范围分别为25.32～202.56 μg/mL和25.19～201.48 μg/mL。

定量限与检测限考察：精密量取混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按拟订色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1分别计算定量限、检测限。结果贝母素甲和贝母素乙的定量限分别为189.9ng和251.9ng，检测限分别为79.1 ng和75.6 ng。

精密度试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为1.51%和0.85%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品（批号为180403）溶液适量，分别于室温下放置 0，1，2，4，8，12 h，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为2.28%和1.77%（n=6），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

重复性试验：称取样品（批号为180403）适量，精密称定，同法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果贝母素甲和贝母素乙平均含量分别为 36.619 μg/g和 15.677 μg/g，RSD分别为2.47%和2.24%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号为180403）6份，每份约2.5 g，精密称定，分别加入一定质量浓度的对照品溶液，同法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取13批样品各适量，同法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表2。可见，各批次间贝母素甲和贝母素乙的含量存在一定差异，平均含量分别为0.030 7 mg/g和0.0136 mg/g，RSD分别为10.02%和9.01%，平均总含量为0.0444mg/g，RSD为8.57%；以平均含量的80%制订含量下限，样品中贝母素甲、贝母素乙及总含量应分别不低于 0.024 6 mg/g，0.010 9 mg/g，0.035 5 mg/g，各批样品均符合要求。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 分析条件选择及优化

贝母类生物碱为异甾类生物碱，文献报道的测定方法有薄层扫描法、HPLC法、柱前衍生化HPLC法、柱前衍生化气相色谱法[3]、近红外光谱法[4]、化学发光分析法等[5]。由于贝母素甲无紫外吸收，贝母素乙仅有末端吸收，不宜用紫外检测器检测，同时考虑到灵敏度及操作的简便性，因此采用HPLC-ELSD法分析，效果较佳。

为了降低灵敏度损失，同时使流动相充分挥发，选择不分流模式。在此基础上考察漂移管温度及载气流速，最终确定漂移管温度70℃，载气流速1.4 L/min。

2015年版《中国药典（一部）》浙贝母药材和复方黄氏响声丸项下均采用HPLC-ELSD法测定贝母素甲和贝母素乙的含量，试验中考察了流动相乙腈-水的比例（70 ∶30，65 ∶35）及二乙胺的加入量（0.030%，0.035%，0.050%）对结果的影响。结果显示，流动相为乙腈-水（65∶35，V/V，含 0.035%二乙胺）时，待测成分分离良好[1]。

3.2 样品前处理方法优化 [1，6-15]

以待测成分含量为指标，优化样品前处理方法。考虑峰面积的适宜性，供试品的取样量选择5 g，保持取样量不变，考察浓氨水-乙醇（1∶2，V/V）混合液的用量为 2，3，5，10，15，20 mL 时的浸泡效果。结果显示，当用量为20 mL时色谱峰基线不稳，10 mL和15 mL的浸泡效果均较佳，考虑到经济性，混合液用量选择10 mL。分别用超声和加热回流方式提取供试品溶液，结果两者提取效果基本一致，超声提取更简便，故选择超声提取。比较乙醚 -氯仿 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）、三氯甲烷 -甲醇（4∶1，V/V）和流动相为超声溶剂时的提取效果，结果显示，用流动相处理的样品很黏稠，糖类物质被提取出而影响测定，采用乙醚-氯仿-乙醇（50∶16∶5，V/V/V）作为超声溶剂，提取效果最佳，可满足测定要求。考察超声提取溶剂量分别为15，25，50 mL时的提取效果，结果表明，加入混合提取液25 mL即可将贝母素甲、贝母素乙提取完全。设置超声时间为15，30，45 min，考察提取效果，结果超声处理30 min即可将贝母素甲、贝母素乙提取完全。比较乙腈、水、甲醇、流动相4种复溶溶剂，结果显示，贝母素甲、贝母素乙在水中的溶解性较差，水复溶样品未见出峰，用流动相溶解样品处理效果最佳，可满足测定要求。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性均良好，可用于测定黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙的含量。