反相高效液相色谱法同时测定呋柳粉中水杨酸、苯甲酸和呋喃西林含量

戴安印，刘洁琼，谷 娜，郭胜才

（中国人民解放军第一一七医院，浙江 杭州 310013）

呋柳粉为我院研制的非标准制剂，主要成分有水杨酸、苯甲酸、硼酸、呋喃西林和鞣酸等，有杀菌、消炎、收敛和抑制霉菌生长作用，临床主要用于治疗各种足癣、手癣，已在我院临床使用多年，疗效显著。我院现行的呋柳粉质量标准中仅有定性鉴别，缺少对主要成分的含量测定。为了更好地控制该制剂的产品质量，保障临床用药安全，本研究中参考2015年版《中国药典（二部）》及文献 [1-7] ，建立了同时测定呋柳粉中水杨酸、苯甲酸和呋喃西林含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；FA2004B型电子分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；pHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-100DY型医用数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

苯甲酸对照品（批号为100419-201302，纯度为100.0%），水杨酸对照品（批号为10906-201104，纯度为99.9%），呋喃西林对照品（批号为101167-201001，纯度为99.4%），均购自中国食品药品检定研究院；呋柳粉（我院自制，批号分别为 20170425，20170609，20171029，规格为每盒30 g，含水杨酸、苯甲酸各9.375g，呋喃西林0.937 5 g）；甲醇（色谱纯，江苏省淮安市恒天工贸有限公司）；水为纯化水；硼酸、鞣酸为药用标准，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠（用磷酸调pH至7.0，30 ∶70，V/V）；检测波长：275 nm；流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。在此色谱条件下，各待测成分峰形良好分离度均大于1.5，理论板数以水杨酸、苯甲酸和呋喃西林峰计均大于3 000。

2.2 溶液制备

称取按处方比例配制的硼酸、鞣酸阴性药粉0.0962 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水约80 mL，50℃超声30 min使溶解，冷却至室温，加水定容，摇匀，滤过，即得阴性对照溶液。称取样品（批号为20171029）0.095 7 g，精密称定，同法制得供试品溶液。称取苯甲酸对照品0.074 4 g，水杨酸对照品0.075 8 g，呋喃西林对照品0.010 1 g，精密称定，同法制得对照品贮备液，精密量取4 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密量取2.2项下3种溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件分别注入液相色谱仪，记录色谱图，详见图1。可见，阴性对照溶液在水杨酸、苯甲酸、呋喃西林峰保留时间处无干扰，专属性良好。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取2.2项下对照品贮备液2，3，4，5，6 mL，置 10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，作为线性系列供试品溶液，精密量取10 μL，进样测定，记录色谱图，分别以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，水杨酸为Y1=2.00X1-9.65，r=0.999 7（n=5），苯甲酸为Y2=4.96X2-17.74，r=0.999 6（n=5），呋喃西林为Y3=27.52X3-31.41，r=0.999 6（n=5）。结果表明，水杨酸、苯甲酸和呋喃西林质量浓度分别在 151.45～454.35 μg/mL、148.81～446.40 μg/mL、20.08 ～60.24 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：在拟订色谱条件下，精密量取2.3项下3号标准曲线工作液，重复进样6次，记录色谱图，测定峰面积。结果苯甲酸、水杨酸及呋喃西林峰面积的RSD分别为0.70%，0.69%，0.67% （n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：称取同一批样品（批号为20171029）约0.1 g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果苯甲酸、水杨酸及呋喃西林含量的RSD分别为0.72%，0.65%，0.99%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：称取样品（批号为20171029）适量，依法制备供试品溶液，室温下于 0，4，8，12，24 h 时分别进样10 μL，记录峰面积。结果苯甲酸、水杨酸及呋喃西林峰面积的RSD分别为1.08%，0.72%，0.82%（n=5），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

加样回收试验：称取已知含量的样品（批号为20171029）9份，各12 mg，精密称定，分别置9个25 mL容量瓶（编号1-9）中，加水约15 mL，50℃超声30 min使溶解，冷却至室温，加水定容，摇匀，①②③号容量瓶中各精密加入2.2项下对照品贮备液4 mL，④⑤⑥号瓶中各精密加入5 mL，⑦⑧⑨号容量瓶中各精密加入6 mL，加水定容，摇匀，即得。依法进样测定，分别记录峰面积，计算平均回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

称取3批样品，精密称定，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定（%，n=3）

3 讨论

3.1 检测波长选择

将苯甲酸、水杨酸和呋喃西林对照品的稀溶液用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描，结果显示，苯甲酸在230nm波长处，水杨酸在230nm和300 nm波长处，呋喃西林在260 nm和375 nm波长处有最大吸收，考虑到呋柳粉中呋喃西林的含量最低（约为苯甲酸和水杨酸的1/10），故选择尽量接近呋喃西林最大吸收波长作为检测波长。在275 nm处三者吸收度相近，可同时满足3种成分的紫外检测，色谱峰分离度好，峰形良好，且不受其他成分干扰，故最终选择275 nm为检测波长。

3.2 流动相选择

通过查阅文献 [3-6] ，比较了不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸氢二钠、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-1%冰醋酸溶液等流动相系统，发现被测组分的保留时间随着甲醇浓度的增大而减小，当甲醇体积分数为40%时，苯甲酸与水杨酸峰分离度小于1，两峰有部分重叠。通过对色谱峰的分离度、保留时间及峰形等综合考虑，最终选择甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二钠（30∶70，V/V）作为流动相体系。

此外，哈永红等[1]的类似研究中采用高效液相色谱双波长外标法测定足菌清中4种成分（水杨酸、苯甲酸、间苯二酚及呋喃西林），以0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇（用0.1%三乙胺调pH至4.3～4.4，50∶50，V/V）为流动相，以260nm作为呋喃西林和间苯二酚的测定波长，以280nm作为苯甲酸和水杨酸的测定波长，结果满意。

相较而言，本研究中利用RP-HPLC单波长法对呋柳粉中多个成分进行含量测定，方法简单、操作方便，各成分分离度好，峰形良好，且保留时间缩短一半，能显著提高工作效率，适用于医院制剂呋柳粉的质量控制。