番鸭感染MDRV对十二指肠上皮内淋巴细胞数量的影响

丁美珍 福建省光泽县动物卫生监督所 福建光泽 354100

黏膜既存在局部免疫又存在共同免疫系统，黏膜免疫系统是机体相对独立的免疫系统[1]，病原微生物入侵畜禽机体时，肠道黏膜免疫系统能够起到阻碍和抵御作用[2]，在肠道免疫防御中起重要作用的包括上皮内淋巴细胞[3]。因此，需要通过试验为番鸭感染呼肠孤病毒后十二指肠上皮内淋巴细胞数量的变化提供论证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 1日龄番鸭若干；试验毒株及主要材料：番鸭呼肠孤病毒、番鸭种蛋若干。

1.1.2 试验主要试剂和器材 试验室自配的4%多聚甲醛固定液、苏木精染液、1%伊红染液、1%盐酸酒精；处理过的盖玻片及载玻片；恒温水浴锅；恒温干燥箱；高压灭菌锅；移液管；超净工作台；冰箱；组织研磨器；冷冻离心机；切片机；广口瓶；灭菌纱布、剪刀、镊子等。

1.2 试验方法

1.2.1 扩增番鸭呼肠孤病毒 孵化1周的40枚番鸭种蛋，经卵黄囊接种番鸭呼肠孤病毒后第4～6 d共死亡26枚，收取死亡鸭胚的胚体及尿囊液，用组织研磨器、冷冻离心机扩增番鸭呼肠孤病毒，并放入-20℃冰箱中储存待用。

1.2.2 试验动物分组 将100羽1日龄无MDRV感染的番鸭进行随机分组：同居感染组（ICG）40羽、空白对照组（NCG）40 羽、人工感染组（AIG）20 羽。人工感染组的每羽番鸭腿部肌注200 uL番鸭呼肠孤病毒液，攻毒后第3 d将人工感染MDRV并做好标记的番鸭放入ICG组进行感染，标记同居感染时间，试验番鸭都正常进行自由采食和饮水。

1.2.3 取样及组织切片制作

1.2.3.1 取样及固定 同居感染后第2 d、3 d、4 d、6 d、9 d、15 d每组随机抽取番鸭各5羽，用灭菌消毒的试验剪剪取十二指肠肠段约1 cm，无菌洗净后放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3.2 组织切片制备 用常规法将采集的组织样本制备成石蜡组织切片，用中性树胶及盖玻片封片，组织切片采用HE染色。

1.2.3.3 肠绒毛上皮内淋巴细胞计数 光学显微镜下观察肠绒毛上皮内淋巴细胞分布与数量。具体方法为：每个试验组选取5张着色良好的切片，每张切片均随机抽取5根最长且排列整齐的肠绒毛在40×10倍显微镜下进行观察、拍照并计数，对每一百个上皮柱状细胞间的上皮内淋巴细胞进行计数。

1.3 数据统计和处理 用SPSS.17.0软件对试验数据进行分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

正常番鸭十二指肠绒毛结构较为完整，上皮内淋巴细胞数量较多（见图1）；感染呼肠孤病毒的番鸭十二指肠绒毛结构出现破损，计数单位内的上皮内淋巴细胞均相对减少（见图2）。由表1、图3可以看出，NCG组番鸭在试验生长过程中，其十二指肠上皮内淋巴细胞的数量较多且浮动较小；感染MDRV的ICG组番鸭，其十二指肠上皮内淋巴细胞的数量在第4 d先出现明显下降，在无外在干预的条件下，之后略有上升但数量依旧维持在较低水平，与NCG组相比分别降低13.78%、23.73%、33.07%、32.02%、33.68%、30.76%，差异均极显著（P＜0.01）。

图1 正常番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞

图2 MDRV感染番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞

3 讨 论

在试验过程中，发现NCG组的番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞的数量波动不明显，ICG组番鸭在病毒感染后的第2～4 d，其十二指肠上皮内淋巴细胞下降较快，在感染呼肠孤病毒第4 d，十二指肠上皮内淋巴细胞的数量最少。该试验现象表明，呼肠孤病毒感染会破坏肠黏膜结构，致使番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞数量在防御过程中大量减少。感染呼肠孤病毒的番鸭在第6 d、9 d、15 d，其十二指肠上皮内淋巴细胞数量出现明显减少后便维持在一个相对较低的水平，试验数据证明番鸭在感染呼肠孤病毒后十二指肠上皮内淋巴细胞数量出现减少且不易恢复正常。

表1 试验番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞数量情况

图3 番鸭十二指肠上皮内淋巴细胞数量的变化