典型四环素类抗生素对土壤微生物及植物生长的影响

陈敏杰，钱懿宏，于青燕，郭倩，洪智程，徐冬梅

浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015

当前，抗生素在人类和动物细菌性感染疾病治疗、集约化养殖饲料添加剂中长期广泛应用，其造成的环境污染已成为人类面临的重大环境问题之一[1]。据报道，2010年全球抗生素使用量达到10×104～20×104t[2]；2013年我国抗生素用量(16.2×104t)约占全球总用量的一半，其中兽用抗生素占52%[3]；在美国，兽用抗生素甚至占了抗生素总用量的70%[4]。由于抗生素类药物进入动物体内后仅少数被吸收代谢，大部分随粪便尿液排出体外。随着富含抗生素的畜禽粪便有机肥和再生水越来越多地应用于农业生产，使得抗生素持续输入土壤环境而造成严重污染[5-6]。四环素类抗生素(TCs)是具有十二氢化并四苯基结构的一类广谱抗生素，主要包括四环素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)等。该类药物大量使用造成其在畜禽粪便中的高浓度残留，加之其具有相对较高的固-液吸附分配系数，进入环境后更容易在土壤中吸附累积，所以TCs的土壤污染更为突出。我国长江三角洲、珠江三角洲等部分地区土壤中TCs的含量已超过100 μg·kg-1的环境生态毒性效应触发值[7-8]，其生态毒性和健康风险已引起广泛关注。

抗生素以微生物为作用靶标，能杀死或者抑制环境中某些微生物从而对微生物群落结构产生一定影响。土壤生态系统的物质循环和能量流动都是以微生物活动为基础的。抗生素作用下，微生物活性和群落结构首先出现变化，进而影响到土壤植物和动物，土壤微生物、酶活性等生物学指标和动植物的健康状况可反映土壤生态环境质量[9-10]。以TC和OTC为研究对象，采用室内培养试验法，考察TCs对土壤微生物、酶活性等生态指标及植物生长的影响，旨在为抗生素类污染物的生态毒性和潜在健康风险的评价提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

供试土壤为采自浙江大学华家池校区的菜园土。去除土壤表面的杂草、枯叶和1 cm左右的表层土，采样深度为20 cm左右。取回的土样剔除石砾和植物残体等杂物之后，立即过2 mm筛，一部分用于测定土壤理化性质，剩余土壤置于25 ℃恒温培养箱中预培养7 d后进行后续实验。供试土壤基本理化性质如表1所示。盐酸四环素、盐酸土霉素、蛋白胨、琼脂和葡萄糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，鹦哥绿豆种子购于张家口亿沐农业科技有限公司。甲苯、尿素、柠檬酸、高锰酸钾和过氧化氢等试剂(购自国药集团化学试剂有限公司杭州分公司)均为分析纯，水为二次亚沸蒸馏水。

1.2 研究方法

1.2.1 抗生素对土壤微生物及酶活性的影响试验

向装有200.00 g供试土壤的棕色瓶中加入TC、OTC的盐酸水溶液，药物浓度分别设置为0、10、20、40、60、80和160 mg·kg-1，每浓度处理3个重复。充分混匀后放置在恒温培养箱中25 ℃避光培养，试验过程中始终保持土壤湿度在最大持水量的50%～60%左右。分别于培养7、14、21、28和35 d取样进行土壤微生物数量和酶活性等指标的测定。分别用LB固体培养基、PDA固体培养基进行土壤细菌、真菌的计数[11]；采用靛酚蓝比色法、磷酸苯二钠比色法和高锰酸钾滴定法测定土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性[12]。

表1 供试土壤理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the tested soil

1.2.2 抗生素对绿豆种子芽伸长的影响试验

挑选大小一致、健康饱满的绿豆籽粒，按体积比1∶3加入80 ℃的蒸馏水烫种3 min后，加常温蒸馏水浸泡24 h，待种子露白后将绿豆转移至直径为9 cm、铺有双层滤纸的培养皿中，每皿6粒[13]。培养皿中分别加入0、20、40、80和160 mg·L-1的TC、OTC溶液4 mL，放入人工气候箱中避光孵育，每个浓度处理设5个平行，培养设定温度为(22±1) ℃，湿度80%±5%，每隔24 h补水一次。分别于48、96和144 h后测定每个试验组的平均芽长，计算芽长抑制率。

1.2.3 数据分析

实验所得数据使用origin8.0软件进行处理和作图，不同浓度暴露组的土壤酶活性、微生物数量和绿豆芽生长抑制率等采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，并用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析，数据结果采用means±SD的方法，显著性水平为P<0.05。

2 结果(Results)

2.1 TC、OTC对土壤微生物数量的影响

抗生素多为微生物杀灭剂，能杀死或者抑制环境中某些微生物，从而对微生物群落结构产生一定影响。由表2中2种TCs对土壤细菌数量的影响可知，TC最小浓度(10 mg·kg-1)组作用7 d后，土壤细菌数量即显著低于对照组，此后随TC作用浓度的增大，土壤细菌数量变化不明显。14～35 d期间土壤细菌数量随TC暴露浓度增大而呈现显著降低的趋势，不同TC浓度组细菌数量与对照组相比均有显著差异。但TC浓度增至40 mg·kg-1后，土壤细菌数量变化不明显。OTC对土壤细菌的影响趋势与TC类似，不同暴露时间的各浓度组土壤真菌数量均显著低于对照组，但7～21 d期间20～160 mg·kg-1OTC浓度组间，28 d时10～40 mg·kg-1组间、80～160 mg·kg-1组间均无显著性差异。

表3为2种TCs对土壤真菌数量的影响。由表可知，除35 d时OTC的各浓度组外，2种抗生素的各浓度处理组土壤真菌数量与对照组均有显著差异。但整个作用周期内TC的40、80和160 mg·kg-1组间真菌数量无显著差异。OTC对土壤真菌数量的影响也大致呈现这一变化趋势。

2.2 TC、OTC对土壤酶活性的影响

土壤酶直接参与土壤的物质循环和能量代谢过程。其中，脲酶和磷酸酶在土壤氮、磷元素的循环与转化过程中扮演重要角色；过氧化氢酶作为一种氧化还原酶，能够将土壤代谢过程中产生的H2O2分解为H2O和O2，对生物体起到保护作用[14]。图1、图2分别为TC、OTC对土壤脲酶和磷酸酶活性的影响结果。由图1可知，在7～35 d的整个试验周期内，2种TCs对土壤脲酶活性的影响总体上呈现低浓度激活、高浓度抑制的变化趋势。其中，20 mg·kg-1的TC作用28 d后脲酶活性为对照组的1.43倍，激活作用最为明显；而OTC对土壤脲酶的最大激活率为36.7%(20 mg·kg-1作用21 d时)。随着抗生素作用浓度的增大，脲酶活性显著回落。方差分析结果表明，TC最大浓度(160 mg·kg-1)作用35 d和OTC(160 mg·kg-1)作用7、14和21 d脲酶活性均被显著抑制。图2为2种抗生素对土壤磷酸酶活性的影响，由图可知，OTC作用组的土壤酸性磷酸酶活性变化与脲酶相似。而TC作用初期(7、14 d)土壤磷酸酶活性随抗生素浓度的升高呈现抑制-恢复-抑制的变化趋势；作用后期(28～35 d)酶活性则以激活作用为主，尤其以21 d时最为明显。

表2 抗生素对土壤细菌数量的影响(×105 CFU·g-1干土)Table 2 Effects of antibiotics on the soil bacteria (×105 CFU·g-1 dry soil)

注：同一行中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

由图3为2种TCs作用下土壤过氧化氢酶活性的变化，相同浓度、相同作用时间条件下TC对土壤过氧化氢酶活性的影响较OTC更为明显。TC作用下土壤过氧化氢酶总体上呈先激活后恢复的变化趋势，整个试验周期内20、40 mg·kg-1组的过氧化氢酶活性显著高于对照组，尤其以14 d时更为明显；而80、160 mg·kg-1的高浓度组酶活性则又显著低于对照组。

图1 抗生素对土壤脲酶活性的影响注：字母不同表示差异显著(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effect of antibiotics on soil urease activityNote: Different letters denote significant differences (P<0.05); the same below.

表3 抗生素对土壤真菌数量的影响(×105 CFU·g-1干土)Table 3 Effects of antibiotics on the soil fungi (×105 CFU·g-1 dry soil)

注：同一行中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

2.3 TC、OTC对绿豆芽的生长抑制

图4、图5分别为暴露于TC和OTC 48 h的绿豆芽的生长情况，结合表4中抗生素不同暴露时间的绿豆芽生长抑制率和显著性水平分析数据可知，除96 h的作用组外，40 mg·L-1的TC暴露即显著抑制了绿豆芽生长，此后随抗生素暴露浓度的升高，芽长抑制率显著增大。而OTC暴露的情况下，80 mg·L-1浓度组的芽长抑制率才开始显著高于对照组。此外，相同浓度、相同暴露时间条件下的TC对绿豆芽伸长的抑制作用大于OTC。

图2 抗生素对土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig. 2 Effect of antibiotics on soil acid phosphatase activity

图3 抗生素对土壤过氧化氢酶活性的影响Fig. 3 Effects of antibiotics on soil catalase activity

图4 TC对绿豆芽48 h的生长抑制Fig. 4 Growth inhibition of TC on mung bean sprouts after 48 h exposure

图5 OTC对绿豆芽48 h的生长抑制Fig. 5 Growth inhibition of OTC on mung bean sprouts after 48 h exposure

表4 抗生素对绿豆芽长的抑制率Table 4 The inhibition rate of antibiotics on mung bean sprout growth

注：同一行中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different letters in the same row denote significant differences (P<0.05).

3 讨论(Discussion)

自20世纪50年代美国食品药品监督管理局(FDA)首次批准抗生素用作饲料添加剂以来，目前全世界范围内畜禽和水产养殖中的抗生素用量已远高于人类抗生素使用量[15]。土壤作为抗生素类污染物的最终归宿地，主要来源是畜禽粪便有机肥的农田施用。2011年，我国畜禽粪便总产生量为21.21亿t，其中绝大部分未经过处理便直接施于农田[16]。张慧敏等[17]采集测定了浙江省北部地区41个施用畜禽粪肥和7个未施粪肥农田土壤的抗生素含量，发现施用粪肥的农田表层(0～20 cm)土壤中TCs总含量的平均值为570 mg·kg-1，未施粪肥土壤的TCs含量为21 μg·kg-1。Hamscher等[18]甚至检测到施用液体粪肥的农场土壤中TC浓度高达300 mg·kg-1。高浓度的抗生素残留不仅严重干扰土壤微生物结构群落和活性，也会通过蓄积作用影响植物生长，进而对人类健康构成潜在威胁[19]。Yang等[20]研究发现，10 mg·kg-1OTC作用下，小麦根际土壤微生物结构群落显著减少，细菌、放线菌数量分别减少了22.2%和31.7%，碱性磷酸酶活性的抑制率达41.3%。笔者的研究结果表明，10 mg·kg-1TC作用下，土壤细菌和真菌数量减少率最大分别达80.67%和74.01%，相同浓度OTC暴露后土壤的细菌和真菌数量减少率最大分别达86.91%和57.20%，TCs作为广谱抗生素显著抑制土壤微生物生长。同时可知，土壤细菌较真菌对TCs的污染更为敏感，与徐晨光等[21]、张浩等[22]的研究结果相似。本研究结果表明，除TC对土壤酸性磷酸酶和OTC对土壤过氧化氢酶活性主要表现为激活作用外，总体上TC、OTC暴露后土壤酶活性呈低促高抑的变化趋势。在35 d的作用周期内，TC和OTC对土壤脲酶活性的最大抑制率分别达到45.75%和32.61%。这可能是由于外源TC和OTC杀灭了部分土壤微生物，致使死亡细胞的胞质结构崩解、细胞膜破裂，游离的胞外酶增加，从而使游离胞外酶活性增强。此后，随着抗生素暴露浓度的进一步增大，TC和OTC与土壤酶分子中的活性部位包括巯基和含咪唑的配位体等结合，形成较稳定的络合物，抑制酶的活性中心，使酶活性降低[23]。外源TC、OTC可能通过改变土壤水解酶活性从而影响土壤营养成分的转化，对作物生长形成间接影响。

绿豆芽生长抑制试验结果表明，80 mg·L-1的TC、OTC暴露下，绿豆芽的芽伸长被显著抑制，并且随着抗生素浓度的增大，芽长抑制率大幅升高。根据文献报道，TCs对植物的毒性作用主要表现在种子萌发和植物生长行为等方面。Kong等[24]通过水培试验研究发现，0.002～0.2 mmol·L-1的OTC暴露下,紫花苜蓿芽和根的生长抑制率分别达到61%和85%。绿豆芽长生长抑制可能因为蛋白质合成受到抑制或根际微生物死亡导致营养盐匮乏。刘娣等[25]的土培实验证明，小白菜对TCs的敏感性为根长>发芽率>生物量。TCs可能通过改变植物抗氧化酶的活性，破坏叶片内部结构，进而抑制植物光合作用等方式来影响植物的生长发育[26]。

综上可知：(1) 低浓度TC和OTC作用下的土壤细菌和真菌数量即显著降低，土壤细菌较真菌对TCs的污染更为敏感。除TC对土壤酸性磷酸酶和OTC对土壤过氧化氢酶活性主要表现为激活作用外，总体上TC、OTC作用后土壤酶活性呈低促高抑的变化趋势。

(2) 80 mg·L-1的TC、OTC暴露下，绿豆芽芽伸长被显著抑制，并且随着抗生素浓度的增大，芽长抑制率大幅升高。相同浓度、相同暴露时间条件下的TC对绿豆芽伸长的毒性大于OTC。