基于GEO数据库对骨关节炎滑膜差异基因的筛选及生物信息学分析

程晓平 郑文伟 倪国新

【摘 要】目的：利用生物信息学对骨关节炎与正常关节滑膜间差异基因进行分析，探索骨关节炎的发病机制。方法：从GEO数据库下载关节滑膜基因芯片数据库，利用GEO2R筛选出差异基因，DAVID 6.7数据库对差异基因进行功能GO分析及KEGG信号通路分析，String-db数据库构建蛋白之间的相互作用网络图（PPI），并采用Cytoscape 3.6.1软件获取关键靶基因。结果：GEO2R共筛选出差异基因490个，包含上调基因61个，下调基因429个，其主要涉及细胞分化、细胞生长、骨骼肌器官发育、cAMP反应等生理过程，且主要富集在细胞外基质受体互作、近端肾小管重吸收碳酸氢盐、胃酸分泌、催产素、环磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪细胞因子信号通路中。从PPI网络中共获取13个关键靶基因，包含FOS、SMARCA4、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、SMARCA2、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、TTN、EGR1。结论：利用生物信息学从不同角度揭示骨关节炎与正常关节滑膜间差异基因潜在特征，为骨关节炎的治疗提供新的思路。

【关键词】 骨关节炎;滑膜;差异基因;生物信息学

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见于中老年人的慢性、退行性关节疾病，目前其发病机制尚不明确[1]。以往对OA的研究主要以软骨细胞、关节软骨及软骨下骨为主，但随着研究的不断深入，发现关节中的滑膜在OA的发生发展过程中起着重要调节作用[2]。OA患者常常伴随着滑膜炎，而滑膜炎反过来又会进一步引起关节软骨破坏，加重OA病情[3]。因此，本研究基于GEO数据库获取OA患者和正常人滑膜基因芯片数据，并对其进行处理分析，旨在从中寻找出滑膜调控OA的关键靶点，为OA的治疗提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 资料来源 输入网址（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/），从GEO数据库中下载GSE82107关节滑膜基因表达数据。所采用的平台为[HG-U133-Plus-2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，共有7例正常人和10例OA患者。

1.2 数据分析软件及数据库 GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）、DAVID6.7（https：//david.ncifcrf.gov/）、String-db（https：//string-db.org/）在线分析数据库，Cytoscape 3.6.1分析软件。

1.3 差异基因获取 将7例正常人作为对照组，10例OA患者作为模型组，利用GEO2R的R语言程序对2组滑膜样本的相关基因进行分析。并以P < 0.05且差异倍数|logFC|≥2作为差异基因的筛选条件。

1.4 差异基因分析 采用DAVID 6.7数据库对所获得的差异基因进行功能GO分析及KEGG信号通路分析。采用String-db数据库对差异基因编码蛋白之间的相互作用（PPI）进行分析。采用Cytoscape 3.6.1软件获取PPI网络图中的关键靶基因。

2 结 果

2.1 差异基因 以P < 0.05且差异倍数|logFC|≥2为筛选条件，从2组滑膜样本中共筛选出差异基因490个，其中含上调基因61个，下调基因429个（表1仅列出前10名上调和下调差异表达基因）。同时把上调和下调差异基因的前30名做热图。

2.2 差异基因功能GO分析 将490个差异基因导入DAVID 6.7数据库中进行分析，结果显示，这些基因共涉及58种生物学过程，其中FDR < 0.01的生物过程有30种，包括细胞分化、细胞生长、肌肉结构发育、糖皮质激素反应、骨骼肌器官发育、外部刺激反应、cAMP反应等众多生物学过程，见表2。差异基因功能GO分析结果也显示，这些基因能参与18种细胞组分，且所有FDR < 0.05，其包括肌原纤维、肌节、细胞外空间、T小管、肌浆网膜、跨膜转运蛋白等多种复杂细胞组分，见表3。

同时能参与蛋白质结合分子功能，见表4。

2.3 差异基因KEGG信号通路分析 将490个差异基因导入DAVID 6.7数据库中并进行KEGG信号通路分析，结果显示，这些差异基因共参与6條信号通路（P < 0.05），其包括细胞外基质受体互作、近端肾小管重吸收碳酸氢盐、胃酸分泌、催产素、环磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪细胞因子信号通路，见表5。

2.4 PPI网络分析 将490个差异基因导入String-db数据库获得蛋白间相互作用的PPI网络图，该网络图共340个节点（靶点蛋白）和370边（蛋白相互作用），并以度值（Degree）≥10作为关键靶基因筛选的标准（节点的度值大小表示该节点所能互相作用的蛋白数）。利用Cytoscape 3.6.1软件对PPI网络图中的关键靶基因进行筛选，共筛选出13个关键靶基因，其包括FOS、SMARCA4、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、SMARCA2、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、TTN、EGR1。

3 讨 论

OA属于一种全关节疾病，是肥胖、创伤、年龄等多种因素共同作用的结果，除了影响关节软骨结构功能，还影响滑膜、韧带、肌肉等其他关节组织的完整性[4]。滑膜属于覆盖在关节囊内侧面的一层薄又柔软的结缔组织，其不仅能分泌滑液减少关节表面的摩擦力，而且也能为关节软骨提供所需的营养成分，有利于维持关节的稳定性和灵活性。但当滑膜受到创伤、感染、劳损等刺激时，能够引起滑膜炎并分泌炎症介质，引起软骨基质的降解，加速OA的病理进程[5]。炎性细胞侵入、滑膜细胞增生、血管新生增加等是滑膜炎主要病理特征。滑膜炎也是引起OA关节红肿热痛及功能受损的一个重要原因[6]。因此，本研究从GEO数据库下载关节滑膜基因芯片表达数据，并对其处理分析，旨在寻找出从滑膜方面治疗OA的关键靶点，为OA的治疗提供新理论依据。

本研究从GEO数据库下载关节滑膜基因芯片数据GSE82107，并分为正常组和模型组，利用GEO2R在线对其处理分析。接着以P < 0.05和|logFC|≥2为差异基因的筛选标准，共获得差异基因490个，其中上调基因61个，下调基因429个。这也说明了OA发病机制的复杂性，其并不是简单的某个基因单独起作用，而是众多基因相互作用的结果。为了进一步揭示这些差异基因在OA中扮演的角色，笔者对这些异同基因进行功能GO分析和KEGG信号通路分析。基因功能GO分析结果显示，这些差异基因主要参与细胞分化、细胞生长、肌肉结构发育、糖皮质激素反应、骨骼肌器官发育、外部刺激反应、cAMP反应等众多生物学过程;主要参与调节蛋白结合分子功能;主要参与能肌原纤维、肌节、细胞外空间、T小管、肌浆网膜、跨膜转运蛋白等多种复杂细胞组件中。KEGG信号通路分析结果显示，这些差异基因主要涉及细胞外基质受体互作、近端肾小管重吸收碳酸氢盐、胃酸分泌、催产素、环磷酸腺苷/蛋白激酶G、脂肪细胞因子信号通路。细胞外基质受体互作信号通路与OA炎症反应有着密切关联[7]。催产素信号通路能通过调控基质金属蛋白酶抑制软骨基质的降解[8]。环磷酸腺苷/蛋白激酶G信号通路能够调控软骨细胞功能[9]。脂肪细胞因子信号通路能通过调控众多脂肪因子影响机体脂肪组织功能障碍，并进一步加重OA的病理状态[10]。而近端肾小管重吸收碳酸氢盐和胃酸分泌2条信号通路与OA之间的研究报道甚少。

利用String-db数据库对这些差异基因进行PPI网络分析，其中位于中心的关键靶基因有FOS、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、TTN、CALB1、MAPK12、ADIPOQ、EGR1、SMARCA4、SMARCA2。FOS类似于核转录因子，其能通过调控细胞的分化、生长、分裂、增殖及凋亡等过程，从而改变众多生命活动及过程。当FOS表达降低时，有利于减少OA关节炎症因子的分泌，缓解关节的疼痛[11]。SOCS能通过抑制JAK/STAT途径减少炎症因子表达[12]。SOCS3能够抑制OA关节炎症反应，同时也能够负反馈调节IL-6信号通路[13-14]。LEP属于一种小的非糖基化肽激素，由肥胖基因编码而成[15]。LEP不僅可调节食物摄入量及能量消耗，而且能参与软骨基质代谢、软骨修复、细胞增殖等其他生理过程[16]。肥胖人群的OA发病率显著提高，这并不是单一由于加重关节负荷所致，LEP在OA与肥胖之间有着潜在联系[17]。因此，LEP是一个极有潜力能成为OA症状诊断的生物标志物或治疗靶点。FBXO32作为一种很有潜力的抑癌症基因，广泛存在于机体的各个组织中[18]。在OA关节软骨和体外白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的OA软骨细胞中都发现FBXO32表达明显升高[19]。肌肉萎缩、肌力下降及肌肉减少是关节退变在骨骼肌组织上的一个主要表现[20]。MYOD1、TRIM63在骨骼肌损伤后的修复过程中起着重要调节作用[21-22]。TTN也具有维持骨骼肌细胞结构及功能正常作用[23]。CALB1与多种退行性疾病有关[24]，但目前尚无CALB1与OA的具体研究。MAPK信号通路不仅可以诱导关节软骨分泌炎症因子，加速软骨基质降解，还能参与软骨细胞分化、增殖、凋亡等生命过程的调控[25-26]。而MAPK12是MAPK家族重要成员之一，其与骨肉瘤细胞的迁移和侵袭有着密切联系[27]。ADIPOQ是脂肪细胞因子家族成员之一，对维持关节软骨内环境稳定有着重要作用[28]。在OA关节软骨中EGR1的表达明显提高，且通过下调EGR1能抑制IL-1β介导的软骨细胞炎症反应，延缓关节软骨的退变[29]。SMARCA2、SMARCA在染色质重塑、DNA修复及肿瘤的发生发展过程中都起着关键调控作用[30]，但目前尚无SMARCA2、SMARCA4与OA之间的具体研究。

本研究通过生物信息学方法对正常人与OA患者滑膜中差异基因进行分析，结果说明多个靶点、多条信号通路参与OA的形成。同时笔者也从PPI网络图中筛选出13个关键靶基因，其中FOS、SOCS3、LEP、FBXO32、MYOD1、TRIM63、TTN、MAPK12、ADIPOQ、EGR1在OA已经有较多研究，CALB1、SMARCA4、SMARCA2在OA虽未被研究报道，但也有可能是治疗OA的潜在靶点，有待进一步研究。

4 参考文献

[1] JONSSON H.Following the genetic clues towards treatment of hand OA[J].Nat Rev Rheumatol，2018，14（Suppl1）：503-504.

[2] SI HB，ZENG Y，LIU SY，et al.Intra-articular injection of microRNA-140（miRNA-140）alleviates osteoarthritis（OA）progression by modulating extracellular matrix（ECM）homeostasis in rats[J].Osteoarthritis Cartilage，2017，25（10）：1698-1707.

[3] 韦尼，陈自佳，李苏茜，等.蜡药疗联合美洛昔康治疗膝骨关节炎性滑膜炎36例临床观察[J].风湿病与关节炎，2018，7（1）：18-22.

[4] 杨威，康武林，袁普卫，等.滑膜炎在骨关节炎发病机制中作用的研究进展[J].中国康复理论与实践，2015，21（5）：530-533.

[5] DE HAIR MJ，LECLERC P，NEWSUM EC，et al.Expression of Prostaglandin E2 Enzymes in the Synovium of Arthralgia Patients at Risk of Developing Rheumatoid Arthritis and in Early Arthritis Patients[J].PLoS One，2015，10（7）：e133669.

[6] BRATUS-NEUENSCHWANDER A，CASTRO-GINER F，FRANK-BERTONCELJ M，et al.Pain-Associated Transcriptome Changes in Synovium of Knee Osteoarthritis Patients[J].Genes（Basel），2018，9（7）：e338.

[7] LUO H，YAO L，ZHANG Y，et al.Liquid chromatography-mass spectrometry-based quantitative proteomics analysis reveals chondroprotective effects of astragaloside Ⅳ in interleukin-1beta-induced SW1353 chondro-cyte-like cells[J].Biomed Pharmacother，2017（91）：796-802.

[8] WU Y，WU T，XU B，et al.Oxytocin prevents cartilage matrix destruction via regulating matrix metalloproteinases[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，486（3）：601-606.

[9] REN YM，ZHAO X，YANG T，et al.Exploring the Key Genes and Pathways of Osteoarthritis in Knee Cartilage in a Rat Model Using Gene Expression Profiling[J].Yonsei Med J，2018，59（6）：760-768.

[10] HOUARD X，GOLDRING MB，BERENBAUM F.Homeostatic mechanisms in articular cartilage and role of inflammation in osteoarthritis[J].Curr Rheumatol Rep，2013，15（11）：375.

[11] ORITA S，ISHIKAWA T，MIYAGI M，et al.Percutaneously absorbed NSAIDs attenuate local production of proinflammatory cytokines and suppress the expression of c-Fos in the spinal cord of a rodent model of knee osteoarthritis[J].J Orthop Sci，2012，17（1）：77-86.

[12] 孫晓辉.细胞因子信号抑制因子在骨关节炎患者软骨细胞的表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2013，29（2）：186-189.

[13] KOSKINEN-KOLASA A，VUOLTEENAHO K，KORHONEN R，et al.Catabolic and proinflammatory effects of leptin in chondrocytes are regulated by suppressor of cytokine signaling-3[J].Arthritis Res Ther，2016，18（1）：215.

[14] GUI T，HE BS，GAN Q，et al.Enhanced SOCS3 in osteoarthiritis may limit both proliferation and inflammation[J].Biotech Histochem，2017，92（2）：107-114.

[15] 陈亮，刘玉杰，魏民.瘦素对骨关节炎影响的研究进展[J].现代生物医学进展，2017，22（5）：993-996.

[16] SCOTECE M，MOBASHERI A.Leptin in osteoarthritis：Focus on articular cartilage and chondrocytes[J].Life Sci，2015（140）：75-78.

[17] VUOLTEENAHO K，KOSKINEN A，MOILANEN E.Leptin-a link between obesity and osteoarthritis.applications for prevention and treatment[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2014，114（1）：103-108.

[18] SUKARI A，MUQBIL I，MOHAMMAD RM，et al.F-BOX proteins in cancer cachexia and muscle wasting：Emerging regulators and therapeutic opportunities[J].Semin Cancer Biol，2016（36）：95-104.

[19] KIM HE，RHEE J，PARK S，et al.Upregulation of Atrogin-1/FBXO32 is not necessary for cartilage destruction in mouse models of osteoarthritis[J].Osteoarthritis Cartilage，2017，25（3）：397-400.

[20] LEVINGER P，CALDOW MK，BARTLETT JR，et al.The level of FoxO1 and IL-15 in skeletal muscle，serum and synovial fluid in people with knee osteoarthritis：a case control study[J].Osteoporos Int，2016，27（6）：2137-2143.

[21] YADEN BC，WANG YX，WILSON JM，et al.Inhibition of activin A ameliorates skeletal muscle injury and rescues contractile properties by inducing efficient remodeling in female mice[J].Am J Pathol，2014，184（4）：1152-1166.

[22] NARASIMHAN M，HONG J，ATIENO N，et al.Nrf2 deficiency promotes apoptosis and impairs PAX7/MyoD expression in aging skeletal muscle cells[J].Free Radic Biol Med，2014（71）：402-414.

[23] 李俊平，徐玉明，方衛斌.低氧环境与低氧运动对骨骼肌Titin和Nebulin含量的影响[J].北京体育大学学报，2010，45（1）：42-44.

[24] 何莲子，邓媛媛，高健美，等.钙结合蛋白-D28K在神经退行性疾病中的作用[J].中国新药与临床杂志，2017，36（5）：254-258.

[25] GAO SC，YIN HB，LIU HX，et al.Research progress on MAPK signal pathway in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Zhongguo Gu Shang，2014，27（5）：441-444.

[26] SHI J，ZHANG C，YI Z，et al.Explore the variation of MMP3，JNK，p38 MAPKs，and autophagy at the early stage of osteoarthritis[J].IUBMB Life，2016，68（4）：293-302.

[27] CUI C，SHI X.miR-187 inhibits tumor growth and invasion by directly targeting MAPK12 in osteosarcoma[J].Exp Ther Med，2017，14（2）：1045-1050.

[28] HAMALAINEN S，SOLOVIEVA S，VEHMAS T，et al.Adipokine genes and radiographic hand osteoarthritis in Finnish women：a cross-sectional study[J].Scand J Rheumatol，2018，47（1）：71-78.

[29] NEBBAKI SS，EL MF，AFIF H，et al.Egr-1 contributes to IL-1-mediated down-regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression in human osteoarthritic chondrocytes[J].Arthritis Res Ther，2012，14（2）：R69.

[30] AYDIN ?Z，VERMEULEN W，LANS H.ISWI chromatin remodeling complexes in the DNA damage response[J].Cell Cycle，2014，13（19）：3016-3025.

收稿日期：2018-10-21;修回日期：2018-12-21