胃癌患者手术前后miRNA-101、miRNA-21表达水平及其临床意义

张观朝，徐兵，陈智年

新乡市中心医院普通外科，河南新乡453000 0

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在所有恶性肿瘤中，发病率居第5位，病死率居第3位，且呈逐年增高趋势，严重威胁人类生命健康[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年发现的非编码内源性小分子RNA，负向调控基因表达转录，研究显示，miRNA与多种恶性肿瘤的发生发展有着密切联系，miRNA-101在多种恶性肿瘤中表达下调，是一种抑癌miRNA[2]。研究认为，miRNA-101可通过作用于髓系细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）基因而发挥抗肿瘤作用[3]。miRNA-21在多种恶性肿瘤中表达存在明显异常，多项研究显示miRNA-21在胃癌组织中表达上调，且与患者的临床分期、淋巴结转移等有关[4-5]。本研究拟采用实时荧光定量方法动态检测miRNA-101、miRNA-21在胃癌患者中的表达水平，旨在探讨胃癌可能的发病机制及潜在的治疗靶点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年6月至2017年12月新乡市中心医院诊治的胃癌患者的病历资料。所有患者均行胃癌根治术，且术前均未接受放化疗治疗。共纳入50例胃癌患者作为胃癌组，其中男29例，女21例；年龄41～80岁，平均（60.28±9.42）岁；分化程度：高分化11例，中分化24例，低分化15例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期14例，Ⅳ期6例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移19例。另选取同期健康体检者50例为健康对照组，其中男25例，女25例；年龄35～80岁，平均（58.46±10.29）岁。两组研究对象的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

1.2.1 血浆标本采集胃癌患者分别于术前、术后1周及术后1个月采集清晨空腹状态下外周静脉血5 ml，健康体检者于体检时采集外周静脉血5 ml，3000 r/min离心10 min后分装血浆与血细胞，-80℃下保存备检。

1.2.2 血浆总RNA提取每份血标本取400 μl血浆，提取RNA前再次进行离心（12 000 r/min，4℃10 min），取血浆检测，加入0.8倍血浆体积的TRIzol试剂，充分摇匀，置于冰上15 min，12 000 r/min离心，取上清液。采用核酸蛋白仪对RNA浓度及纯度进行测定。

1.2.3 血浆miRNA-101、miRNA-21检测采用实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测 miRNA-101和miRNA-21，按TaqManmiRNA逆转录试剂盒（购自美国Applied Biosystems公司）说明书进行反转录。反转录条件下转录目的miRNA，95℃ 30 s，95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃20 s，共40个循环，以U6为内参基因，每个标本均检测3次，取所获取的全部样本数据的平均值进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量的方差分析，两组比较采用t检验；计数资料以例数表示，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前胃癌组与健康对照组血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量的比较

术前胃癌组患者血浆miRNA-101相对表达量明显低于健康对照组，miRNA-21相对表达量明显高于健康对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 术前胃癌组与健康对照组血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达水平的比较（± s）

表1 术前胃癌组与健康对照组血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达水平的比较（± s）

组别健康对照组（n=50）胃癌组（n=50）t值P值miRNA-101 7.95±2.04 1.82±0.56 20.490 0.000 miRNA-21 0.97±0.04 8.26±1.83 28.162 0.000

2.2 胃癌患者手术前后血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量的比较

与术前比较，术后1周及术后1个月胃癌患者血浆miRNA-101相对表达量逐渐增高，血浆miRNA-21相对表达量逐渐降低，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。（表 2）

表2 50例胃癌患者手术前后血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达水平的比较（± s）

表2 50例胃癌患者手术前后血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达水平的比较（± s）

注：a与术前比较，P<0.05；b与术后1周比较，P<0.05

miRNA-101 1.82±0.56 5.78±1.27a 7.23±1.86a b 218.396<0.01 miRNA-21 8.26±1.83 3.23±0.85a 1.42±0.37a b 447.702<0.01时间术前（n=50）术后1周（n=50）术后1个月（n=50）F值P值

2.3 不同临床特征的胃癌患者术前血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量的比较

不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况的胃癌患者术前血浆miRNA-101相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=66.285，t=6.104、9.579；P﹤0.05）；不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况的胃癌患者术前血浆miRNA-21相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=53.287，t=14.204、6.534；P﹤0.05）；而不同性别、年龄胃癌患者术前血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表3）

表3 不同临床特征胃癌患者术前血浆miRNA-101、miRNA-21的相对表达水平（ n=50）

3 讨论

miRNA是一类真核生物内源性非编码单链的小RNA分子，长19～23个核苷酸，进化上呈高度保守，能够调节信使RNA的翻译，并在转录后水平负调控基因的表现[6]。近年来，miRNA已成为肿瘤诊断及治疗的研究热点。miRNA-101被发现在多种恶性肿瘤组织中呈低表达，其低表达与肿瘤的发生、发展呈正相关，且低表达miRNA-101的肿瘤患者生存率较低[7]。miRNA-21是最早在人类基因组中检测到的miRNA之一，其在多种恶性肿瘤组织中呈过表达，是实体瘤中最常见的呈高表达的miRNA之一，可能作为一种癌基因参与了肿瘤的发生、发展[8-9]。

外周血肿瘤标志物的检测有创伤小、易于检测、可重复性高等优点，是肿瘤诊断的理想手段。已有研究证实，miRNA-101在胃癌组织中呈低表达，miRNA-21在胃癌组织中呈高表达，且与患者的临床分期、淋巴结转移等有关[10-11]。有研究显示，血浆miRNA-21诊断大肠癌的灵敏度为84.5%，特异度为74.4%，故血浆miRNA-21可能成为肿瘤诊断的新手段[12]。本研究结果显示，术前胃癌组患者血浆miRNA-101相对表达量明显低于健康对照组，miRNA-21相对表达量明显高于健康对照组，这与miRNA-101在子宫内膜癌中的变化类似[13]，提示miRNA-101、miRNA-21可能参与了胃癌的发生。另有研究表明，大肠癌组织miRNA-21表达量较癌旁组织明显增多，亦提示miRNA-21参与了肿瘤的发生发展[14]。本研究未对此进行对比分析，有待进一步补充以增强结果说服力。本研究动态检测胃癌患者血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量发现，与术前比较，术后1周及术后1个月胃癌患者血浆miRNA-101相对表达量逐渐增高，血浆miRNA-21相对表达量逐渐降低，差异均有统计学意义（P﹤0.05）。即手术除去肿瘤后，血浆miRNA-101表达水平迅速升高，miRNA-21表达水平迅速降低，说明miRNA-101、miRNA-21与肿瘤发生密切相关，其表达异常可促使肿瘤发生，且通过检测二者表达变化有助于评估手术疗效。不少研究认为，miRNA-101、miRNA-21与肿瘤病理分期、浸润深度、淋巴结转移等有关[15-16]。本研究显示，不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况的胃癌患者术前血浆miRNA-101、miRNA-21相对表达量比较，差异均有统计学意义，这与上述研究相符。表明血浆miRNA-101、miRNA-21的检测对胃癌分期及转移判断有重要意义。

综上所述，胃癌患者血浆miRNA-101呈低表达，miRNA-21呈高表达。通过检测血浆miRNA-101、miRNA-21的表达变化对判断肿瘤分化程度、临床分期、手术疗效有着一定价值，有望成为肿瘤诊断及随访的新型手段。