血清外泌体miRNA-184在非小细胞肺癌中的表达水平及其诊断效能

刘玉山，闫红江，李春雨北京市东城区第一人民医院呼吸科，北京100075

2河北医科大学第二医院胸外科，石家庄050000 0

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，流行病学调查研究显示，该病的发病率和病死率均较高[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是一种常见的肺癌类型，约占肺癌总数的80%，由于NSCLC起病隐匿，故多数患者就诊时已处于中晚期[2-3]。以往的研究显示，Ⅰ期NSCLC患者术后5年生存率可达80%，而晚期NSCLC患者术后5年生存率仅为15%，且术后复发率极高[4]，因此，寻找NSCLC特异性肿瘤标志物对该病的早期诊疗具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的一种内源性非编码小分子RNA，可参与细胞的增殖、分化及凋亡等过程，在多种组织中均有表达，具有较好的组织特异性[5]。文献报道，外泌体可介导miRNA转运，使其稳定地存在于循环系统中，因肺癌中miRNA表达失调不尽相同，故血清外泌体miRNA具备了成为肿瘤生物标志物的条件[6]。本研究通过对比分析NSCLC患者、肺炎患者及健康体检者的血清外泌体miRNA-184的表达水平，探讨血清外泌体miRNA-184对NSCLC的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年6月至2018年3月于北京市东城区第一人民医院诊治的NSCLC、肺炎患者的临床资料及同期健康体检者的体检结果。纳入标准：NSCLC患者均经组织病理学检查确诊，肺炎患者均经临床检查确诊，且采集标本前均未接受相关治疗。排除标准：NSCLC、肺炎患者的临床资料及健康体检者的体检结果不完整，影响本研究相关数据的统计分析。根据纳入、排除标准，共纳入NSCLC患者66例、肺炎患者60例及同期健康体检者30例。66例NSCLC患者中，男39例，女27例；平均年龄为（51.67±4.96）岁；吸烟38例，占57.58%；病理类型：腺癌41例，鳞癌25例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期30例；有淋巴结转移34例，占51.52%。60例肺炎患者中，男36例，女24例；平均年龄为（51.23±4.42）岁；吸烟31例，占51.67%。30例健康体检者中，男17例，女13例；平均年龄为（50.14±3.57）岁；吸烟17例，占56.67%。NSCLC、肺炎患者与健康体检者的性别、年龄、吸烟比例比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。

1.2 仪器及试剂

7500型实时定量逆转录-聚合酶链反应（quantitativereal-time reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪购自美国应用生物系统（ABI）公司，jem-100cxⅡ型透射电子显微镜购自日本电子公司，分光光度计购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，外泌体提取试剂盒购自SBI公司，逆转录试剂盒、qPCR试剂盒购自美国ABI公司，总RNA提取试剂（Trizol）试剂购自Invitrogen公司，纳米颗粒跟踪分析仪Nanosight NS300购自Malvern公司。

1.3 研究方法

NSCLC、肺炎患者与健康体检者的血清标本均于采集24 h内予以离心处理，取上层血清，于-80℃保存待检，全过程避免溶血。

1.3.1 血清外泌体的提取及鉴定血清外泌体采用SBI公司的外泌体提取试剂盒进行试剂提取，严格按照试剂盒说明书进行操作。将提取到的外泌体样品染色后置于电镜下，观察其颗粒形态。外泌体颗粒浓度采用Nanosight NS300仪进行检测，将样品稀释5000、10 000或20 000倍，使其浓度介于108～109/ml，检测时Nanosight NS300仪的阈值为5，各检测参数在检测过程中保持不变。

1.3.2 外泌体中miRNA-184的检测将外泌体样品应用Trizol试剂裂解后提取总RNA，经硅胶模吸附柱纯化后行逆转录（反应条件：16℃15 min，42℃60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min），获得cDNA样品。采用荧光染料参入法（SYBR Green）对外泌体中miRNA-184进行定量检测。采用相对定量法，应用2-△△Ct方法计算外泌体中 miRNA-184 表达水平，以miRNA-39作为外参基因（加入trizol裂解后迅速加入秀丽线虫miRNA-39），∆Ct=CtmiRNA-184-CtmiRNA-39。

1.4 观察指标

比较NSCLC、肺炎患者与健康体检者的血清外泌体miRNA-184的表达情况，并分析不同临床特征的NSCLC患者的血清外泌体miRNA-184的表达情况，以及血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清外泌体的鉴定

电镜下观察染色后的外泌体样品，视野内可见具有脂质双层膜囊状、直径约为200 nm的圆形颗粒（图1）。Nanosight检测结果显示，样品中颗粒分散均匀，主要分布于直径35～190 nm，直径呈单峰正态分布曲线（峰值约为54 nm处）（图2）。

2.2 血清外泌体miRNA-184的表达情况

图1 电镜下外泌体颗粒形态（磷钨酸染色，×50 000）

图2 Nanosight检测血清外泌体浓度与荧光强度图

NSCLC、肺炎患者及健康体检者的血清外泌体miRNA-184的表达水平比较，差异有统计学意义（F=10.207，P﹤0.05）；NSCLC患者血清外泌体miRNA-184表达水平明显高于肺炎患者和健康体检者（t=6.332、4.810，P﹤0.01）（图 3）。进一步分析不同临床特征的NSCLC患者的血清外泌体miRNA-184的表达情况，结果发现TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的NSCLC患者的血清外泌体miRNA-184相对表达量分别为（1.51±0.17）和（1.46±0.11），均明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者的（1.07±0.13）和（1.01±0.16），差异均有统计学意义（t=11.342、12.730，P﹤0.01）；病理类型为腺癌与鳞癌的NSCLC患者的血清外泌体miRNA-184相对表达量分别为（1.19±0.21）和（1.25±0.10），两者比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。

2.3 血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能

图3 3组血清外泌体miRNA-184的表达情况

采用ROC曲线评价血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能，曲线下面积为0.915（95%CI：0.84～0.99），miRNA-184最佳的相对表达量临界值为1.26，诊断的灵敏度为77.4%，特异度为96.8%。（图 4）

3 讨论

图4 血清外泌体miRNA-184诊断NSCLC的ROC曲线

近年来，随着临床对NSCLC诊断标志物的不断研究，miRNA受到越来越多的关注，成为肿瘤生物标志物研究的新领域之一[7]。尽管手术联合同步放化疗可提高早期NSCLC的临床治愈率，但对于晚期患者尚缺乏有效的治疗方法[8]。因此，探寻早期NSCLC诊断标志物具有重要的临床意义。研究表明，miRNA-449、miRNA-142、miRNA-34a和miRNA-29b等与NSCLC的发生发展有关[9]。虽然miRNA对NSCLC的早期诊断具有一定的价值，但多数研究基于肿瘤组织或细胞miRNA的表达差异，在获得检测miRNA的肿瘤组织时需行穿刺或有创手术等，因此，此种检测方式不便于临床NSCLC的广泛筛查。以往的研究显示，人体血液、唾液、尿液中均可检测到miRNA，且外周血miRNA作为肿瘤标志物已取得一定的效果[10]。季禹乔等[11]的研究显示，血清miRNA-21在早期NSCLC中具有较高的诊断效能，miRNA-21在NSCLC患者血清中高表达。吴伟东等[12]的研究显示，miRNA-506诊断NSCLC的灵敏度为81.10%，特异度为86.90%，有助于临床对NSCLC患者病情的诊断。最近的研究显示，血清miRNA对早期NSCLC的临床诊断具有一定的参考价值[13]。以上研究结果说明，血清miRNA有望成为NSCLC的诊断标志物，但由于血清成分复杂，可能导致miRNA来源不明，从而对检测结果产生一定的影响。资料显示，miRNA在血清外泌体内稳定存在，其成分没有血清复杂，且样本可通过无创方式获得，这使血清外泌体miRNA具备了成为无创、可靠的肿瘤生物标志物的条件[14]。本研究结果表明，纯化的血清样品中含有大量的外泌体颗粒，并且具备既往报道的外泌体特性。

miRNA为高度保守的非编码小分子单链RNA，以多种形式存在于动植物及病毒中。近年来有学者报道，外泌体中miRNA分子与血液中总的miRNA分子表达谱具有明显差异[15]。本研究发现，NSCLC患者血清外泌体miRNA-184表达水平明显高于肺炎患者和健康体检者，进一步采用ROC曲线评价血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能，ROC曲线下面积为0.915（95%CI：0.84～0.99），诊断的灵敏度为77.4%，特异度为96.8%，提示血清外泌体miRNA-184对NSCLC的诊断效能较高。Shen等[16]的研究显示，血清外泌体miRNA-21对早期NSCLC的诊断具有一定的价值，或将成为肺癌辅助诊断标志物。另有学者研究报道，血清外泌体miRNA-146a-5p水平对预测NSCLC的治疗效果具有重要的作用[17]。这说明血清外泌体miRNA与NSCLC的发生发展密切相关，其或将成为早期NSCLC的一个非侵入性诊断标志物。

综上所述，miRNA-184在NSCLC患者血清外泌体中高表达，且对NSCLC的诊断效能较高，可能成为NSCLC的一个新的诊断标志物。后续需要加大样本量的收集，进一步探讨血清外泌体miRNA与NSCLC的相关性，为NSCLC临床早期诊断及治疗提供参考依据。