纳米氧化锌经口染毒对C57BL/6J小鼠外周脏器的影响*

韩 洁，田 蕾，刘子怡，方 振，袭著革△，刘晓华△

(1. 天津体育学院，天津 301617；2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津 300050；3. 滨州医学院，山东 烟台 264000)

纳米材料由于其体积小、比表面积大，逐渐渗透于人们生活和生产的各个方面。纳米氧化锌颗粒(zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs)是一种新型的金属氧化物纳米颗粒，一方面由于其高效的紫外线吸收性能，被广泛应用于化妆品和防晒霜中，另一方面由于具有抗菌特性，被用于食品工业添加剂和食品包装，另外，它们还被用于农业杀菌剂以及抗癌药物等生物医学领域[1]。ZnO NPs可通过食品、食品包装和药物载体直接进入人体，也可能通过食物链使泄露于环境中的ZnO NPs被人体摄入。此外，一些通过呼吸进入人体的纳米颗粒还可以经肺黏膜纤毛系统排出后，被吞入胃肠道[2]。通过胃肠道途径进入机体的ZnO NPs会对人体产生哪些损伤效应，成为科研工作者不得不考虑的问题。Esmaeillou[3]等报道ZnO NPs暴露5 d可损伤肝，肾和肺。Hong[4]等报道ZnO NPs可诱导肝脏组织损伤。 Kim[5]等报道口服不同大小粒径的ZnO NPs 14 d可在体内和体外诱导免疫毒性。目前，关于ZnO NPs经口灌胃暴露的毒性效应研究已有报道，但是这些研究要么使用较高浓度的纳米氧化锌，要么暴露时间较短，并没有低浓度长期暴露的研究结果。本文主要探讨食品或包装中的纳米氧化锌对机体的毒性，因此，选择使用浓度较低的ZnO NPs，及60 d 的暴露时间，分析其毒性靶器官，为今后食品行业使用ZnO NPs的用量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

ZnO NPs，白色粉末，其质量分数为 99.9%，颗粒形态不规则，粒径在20～80 nm之间(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供)，在4℃下，经超声仪处理30 min后，用生理盐水配置成2 mg/ml的悬浮液。

血生化分析仪(C501，罗氏)，连续可见光谱酶标仪(xMark Microplate Spectrophotometer，Bio-Rad)，炎症因子PAF，IL-6和TNF-α检测试剂盒酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(北京博奥拓达)，10%甲醛固定液、无水乙醇、二甲苯和苏木素-伊红(HE)染液(Solarbio公司)。

1.2 实验动物分组及染毒

10周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于一个环境控制室里，温度保持在(21±1)℃，湿度在50%±5%，12 h的光照/12 h的黑暗循环，自由活动，普通饲料，正常饮食饮水，适应性饲养一周后纳入实验。

20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为两组，对照组和实验组，每组10只，实验组将ZnO NPs溶液以20 mg/kg体重的剂量连续灌胃染毒60 d，根据小鼠体重灌胃体积为0.2～0.3 ml,对照组除了使用生理盐水代替ZnO NPs溶液外，其余条件均相同。

1.3 小鼠一般状况观察及体质量测定

灌胃后每日观察小鼠活动,饮食，皮毛，精神等状况并做详细的记录。灌胃期间每周称取体重，记录小鼠每周的体重变化。

1.4 血液生化指标测定

实验结束后，小鼠经眼球取血，室温放置20 min后，将血液以3 000 r/min，4℃，离心10 min，收集上清液，于-80℃冷冻保存。利用全自动生化分析仪测定血中总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin, ALB)、球蛋白(globulin, GLOB)、白蛋白/球蛋白比值(albumin/globulin ratio, A/G)、谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、谷草/谷丙转氨酶比值(aspartate transaminase/alanine transaminase ratio, AST/ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine, Crea)、尿酸(uric acid, UA)、血糖(blood glucose, GLU)、胆固醇(cholesterol, CHOL)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)。

1.5 血清炎性因子测定

采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中PAF、IL-6和TNF-α水平，按照试剂盒操作步骤，用酶标仪检测待测样品及标准品450 nm处的OD值。根据OD值和浓度据绘制出标准曲线并计算各样本浓度。

1.6 病理检查

将小鼠麻醉后取心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织，于4%的多聚甲醛溶液中固定，72 h常规冲洗，脱水透明，石蜡包埋，4～6 μm组织切片，60～65℃烤片 ,30 min 脱蜡，HE染色，封片，于光学显微镜下观察各组织的病理变化。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 ZnO NPs经口染毒对小鼠一般状况及体重的影响

对照组小鼠精神状况良好，饮食、活动情况均正常，皮毛光亮，ZnO NPs灌胃60 d后，小鼠出现活动减弱，行动迟缓，进食饮水略减，皮毛疏松无光泽。每周体重监测结果显示：实验组小鼠的体重与对照组比较无显著性差异(图1)。

Fig. 1 Changes of body weight after exposure to ZnO NPs(n=10)

2.2 ZnO NPs经口染毒对小鼠血糖、血脂的影响

ZnO NPs灌胃60 d后，小鼠血糖水平较对照组有升高趋势，但无统计学差异，而血液中CHOL、TG、HDL和LDL含量呈现降低趋势，也无统计学差异(图2)。

Fig. 2 Changes of blood glucose and blood lipids after exposure to ZnO NPs(n=10)

2.3 ZnO NPs经口染毒对小鼠肝、肾功能的影响

ZnO NPs灌胃60 d后，染毒组血中ALB含量、A/G值、AST/ALT值和ALP活性显著高于对照组(P<0.05，P<0.01)，AST活性呈现升高趋势，提示存在肝功能异常。而染毒组血中UA和BUN含量显著高于对照组(P<0.05和P<0.01),提示此暴露模型可导致小鼠肾功能异常(表1)。

2.4 ZnO NPs经口染毒对血清炎症因子的影响

与对照组相比，ZnO NPs暴露60 d可导致小鼠血清中炎症因子PAF、IL-6和TNF-α均呈现下降趋势，但均无统计学差异,表明经口染毒未引起小鼠出现系统性炎症反应(表2)。

2.5 ZnO NPs经口染毒对各脏器组织结构的影响

心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织切片经HE染色后，利用光学显微镜观察病理变化。结果显示：对照组小鼠心肌细胞排列整齐，胞浆丰富，无变形或坏死，染毒组小鼠心肌部分区域出现浑浊肿胀，细胞核溶解、形状不规律；对照组小鼠肝脏肝小叶结构清晰可见，肝细胞大小一致，排列有序，肝细胞无变性坏死，染毒组小鼠肝脏可见较轻的炎性病变,出现灶性或小灶性坏死，坏死的肝细胞有核溶解、核破裂及核浓缩的现象；对照组小鼠脾脏结构清晰，红髓及白髓比例正常，染毒组小鼠可见脾色素沉着较少，脾脏红髓颜色变淡，红髓白髓界限不清晰；对照组小鼠肺组织中肺泡结构清晰，肺泡上皮细胞无异型，无炎性改变，染毒组小鼠可见肺泡扩张不均匀，肺泡壁增厚，肺泡壁毛细血管扩张，充血，出现轻或中度间质性炎症；小鼠经ZnO NPs染毒60 d后，肾脏和小肠未见明显的病理变化(图3见彩图页Ⅱ)。

IndexesControlTreatmentTP(g/L)59.80±4.2860.08±4.14ALB(g/L)21.72±1.8425.28±2.22∗GLB(g/L)38.08±3.5934.80±2.73A/G0.56±0.030.74±0.05∗∗ALT(U/L)53.25±25.9144.60±6.69AST(U/L)97.75±35.98119.20±40.46AST/ALT1.72±0.432.63±0.62∗ALP(U/L)108.80±28.10156.40±25.18∗BUN(μmol/L)5.56±1.168.36±1.17∗∗Crea(μmol/L)9.20±0.849.00±2.00UA(μmol/L)59.00±10.10152.00±52.18∗

TP: Total Protein；ALB： Albumin；GLB： Globulin；A/G： Albumin/Globulin；ALT： Alanine aminotransferase；AST： Aspartate aminotransferase；AST/ALT： Aspartate aminotransferase/Alanine aminotransferase；ALP： Alkaline phosphatase；BUN: Blood urea nitrogen; Crea： Creatinine; UA: Uric acid

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

GroupPAF IL-6 TNF-αControl2.12±0.62115.54±29.48111.57±35.13Treatment1.92±0.33105.73±35.4697.18±51.33

PAF: Platelet activating factor; IL-6: Interleukin-6; TNF-α : Tumor necrosis factor-α

3 讨论

越来越多的研究表明，纳米颗粒可对肝脏、肾脏和脾脏等组织产生毒性作用[6]。纳米氧化锌作为一种被广泛使用的纳米颗粒物，已证实对多种细胞，如人肺上皮细胞[7]、胚胎肺成纤维细胞[8]和支气管上皮细胞[9]等产生损伤作用。鉴于ZnO NPs在化妆品、食品工业和生物医药领域的应用，其经胃肠途径进入机体产生的毒性效应成为必须关注的问题。目前，关于ZnO NPs经口暴露的毒性评价研究尚未广泛开展，现有的研究存在纳米氧化锌使用浓度较高，或暴露时间较短的问题，缺乏低浓度、长期暴露的毒性评价结果。因此，本文选择将ZnO NPs以灌胃方式，采用20 mg/kg体重的染毒剂量和60 d染毒时间，观察经口染毒对小鼠外周脏器的影响。

染毒组灌胃60 d后，小鼠出现活动减弱，行动迟缓，进食饮水略减，皮毛疏松无光泽。李慧民[10]等研究发现，40、80/160 mg/kg连续灌胃90 d可导致染毒组小鼠活动较少，有个别小鼠出现弓背、竖毛并出现死亡现象,其可能与过量的纳米粒子进入中枢神经系统引发神经细胞毒性有关，其作用机理还需进一步研究。据美国卫生部报道，在人体内，摄入高水平的锌几个月会降低HDL胆固醇的水平，本实验中CHOL、TG、HDL和LDL含量均下降，但都无显著性变化，Kim[11]等研究表明，100 nm ZnO NPs 经口染毒90 d,500 mg/kg剂量可导致大鼠血糖和血清TG、TC显著降低,可能是本实验ZnO NPs浓度低尚未引起小鼠脂质代谢失衡。此外，通过对血清炎症因子PAF、IL-6和TNF-α的测定来评价ZnO NPs的免疫毒性，发现都有下降的趋势，但是并无显著性差异, Ansar S[12]等研究发现，600 mg/kg ZnO NPs连续灌胃7 d可导致IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著上升，低剂量ZnO NPs慢性口服暴露可能不会引起免疫毒性。

Ben-Slama[13]等研究发现，10 mg/kg ZnO NPs连续灌胃5 d可导致雄性大鼠AST和ALT活性显著升高。Abbasalipourkabir[14]等研究发现，每日腹腔注射50、100/150、和200 mg/kg ZnO 10 d可显著增加AST活性,注射150和200 mg/kg ZnO 10 d可显著增加ALT活性。在本实验中，染毒组血中AST活性具有升高趋势，尽管与对照组相比差异无显著性，但结合AST/ALT的比值以及ALP活性显著升高，提示存在肝功能异常，Almansour[15]等研究发现，2 mg/kg ZnO NPs腹腔注射21 d可导致肝组织出现炎症，水肿变性等现象，本实验在肝脏中发现炎症病变等病理变化也证实存在局部肝损伤，但本研究中采用的染毒方式并未诱导严重的肝损伤和肝功能紊乱。Kong[16]等研究也发现，40 mg/kg ZnO NPs经口染毒90 d可导致小鼠血中AST和ALT活性升高，但与对照组相比差异不显著性，而从80 mg/kg染毒剂量开始，这两个指标显著升高。提示ZnO NPs染毒浓度是影响肝功能的因素之一。另外，染毒组血中ALB含量和A/G比值显著升高，GLB含量有下降趋势，提示可能存在肝脏代偿合成白蛋白增加，而球蛋白消耗增加。我们认为，以上的结果可能与长期暴露导致肝脏的功能代偿及机体处于慢性应激状态有关。本实验中，染毒组小鼠血中UA和BUN含量显著升高，表明存在肾功能障碍，但并未发现明显的病理结构异常，提示本模型中ZnO NPs所致的肾损伤是功能性的。Wang[17]等发现，300和400 mg/kg ZnO NPs 灌胃14 d也可导致小鼠血中UA升高。

本研究发现，20 mg/kg ZnO NPs经口灌胃60 d可导致肺组织出现间质性炎症，脾脏色素沉着较少，红髓颜色变淡，脾脏白色髓质增多，心肌部分区域出现混浊肿胀的病理变化。这些发现在其他不同浓度ZnO NPs染毒的啮齿类动物中得到验证。Esmaeillou[3]等以333.33 mg/kg ZnO NPs给大鼠连续灌胃5 d，发现肺组织出现浆液性炎症、肺泡严重充血、肺水肿等病理变化。Wang[18]等以5 g/kg ZnO NPs急性经口染毒14 d，发现可导致脾脏肿大。HC[19]等以1.1和4.9 mg/m3ZnO NPs吸入暴露7 d，发现可导致SD大鼠心脏出现炎症和纤维化，暴露30 d后心肌出现变性和坏死。在本实验中，对肠组织进行病理检测并未发现异常，吴城[20]等研究发现，以960 mg/kg口服染毒ZnO NPs使得小鼠肠黏膜出现上皮细胞萎缩等症状，可能是本实验ZnO NPs剂量低尚未引起肠出现损伤。

综上所述，ZnO NPs灌胃染毒60 d未引起C57BL/6J小鼠出现系统性炎症，但可诱导心脏、肝脏、脾脏和肺脏出现轻度的病理变化，并导致肝功能和肾功能异常。因此，随着ZnO NPs等纳米材料的广泛应用，了解纳米材料对机体的毒性效应，对其进行安全性评价成为纳米科学领域的重要研究内容。