姜黄素对过度训练致大鼠脾脏细胞凋亡的调控作用及其机制*

周海涛，曹建民，胡 戈，张 静，郭 娴，牛衍龙，王安琪，杜 堃，魏江山，关云鹏，邵芙蓉，赵 卓△

(1. 北京联合大学，北京 100023；2. 北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100191；3. 北京体育大学，北京 100084；4. 赣南医学院，江西 赣州 341000)

脾脏作为机体最大的免疫器官，是机体细胞/体液免疫的中心。长时程、大强度运动引发的过度训练不仅会使机体出现明显的疲劳感和免疫力低下，甚至还会造成脾脏结构及功能损伤，细胞凋亡加剧是其重要原因之一[1]。氧化应激则是诱导脏器细胞凋亡加剧的主要影响因素[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)可通过调控下游多种抗氧化酶的基因表达，缓解和改善氧化应激对机体的影响和损伤。同时，Nrf2通过与B淋巴细胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein，Bcl-2)抗氧化反应元件的结合，调控抗/促凋亡蛋白表达，抑制和延缓细胞凋亡[3]。本课题组前期相关研究发现姜黄素可有效地缓解氧化应激[4]，抑制和延缓过度训练引发的过度细胞凋亡和运动性脏器损伤，保护脏器组织结构和功能正常[5-6]。本实验结合前期研究，通过观察各组大鼠脾脏脏组织形态，计算脾脏系数，结合脾脏组织氧化应激相关指标、细胞凋亡及Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达水平变化，探讨姜黄素通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路在缓解大鼠过度训练所致氧化应激及脾脏细胞过度凋亡、保护脾脏的作用机制，为姜黄素在运动营养领域的深度应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

63只SPF级雄性Wistar大鼠(49 d龄，218.4±10.7 g)，购自北京大学医学部实验动物科学部(生产合格证编号 SCXK(京) 2016-0010)。北京体育大学SPF级动物实验室饲养，温度20～24 ℃，相对湿度55%～75%，正常昼夜节律。4 d适应性饲养后进行3 d适应性游泳训练，20 min/d，有3只大鼠无法完成适应性训练，剔除后将剩余大鼠随机分为安静对照组(C组，n=12)、过度训练组(OM组，n=24)和姜黄素+过度训练组(COM组，n=24)。

1.2 训练方案与干预

OM、COM组采用8周递增负荷游泳训练，具体方案[7]见图1。训练过程中，若发现大鼠下沉不能自主上浮，计时10 s后迅速托出水面，休息5～10 min，然后继续训练直至完成训练方案。

姜黄素(纯度≥99%)购自陕西源泰生物科技公司(批号17012571)，使用0.5%羧甲基纤维素纳作为助溶剂，配制姜黄素混悬液，4℃存放备用。C组常规饲养，不进行任何运动干预。根据文献[8]及预实验结果，COM组大鼠姜黄素干预剂量为200 mg/(kg·d)，灌胃体积为5 ml/kg；其他组灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素纳。8周训练期间，每天采用专业灌胃器在训练前1 h灌胃1次。

Fig. 1 Swimming training program of rats

Note: swimming time (min) × load percentage of the body weight (body weight %) × frequency of training

1.3 实验动物取材

受运动量、负重、恢复时间等多种因素影响，游泳训练中易出现大鼠意外死亡现象。本研究中，全部训练结束后OM、COM组大鼠分别剩余11只和14只。末次训练结束后24 h对大鼠进行称重，乙醚麻醉后颈总动脉取血，室温自然凝固，待血清出现后4℃3 000 r/min，离心10 min，分离血清，-20℃冻存待测血清睾酮(testosterone，T)和皮质酮(corticosterone，Cor)。无菌环境下，迅速取脾脏，剥离周围脂肪组织，置于预冷的生理盐水中冲洗，滤纸吸去多余液体后称重以计算脾脏指数。切取1 cm×0.5 cm×0.2 cm脾脏组织浸入4%多聚甲醛常温固定待观察脾脏组织病理变化和检测脾脏组织细胞凋亡水平、Nrf-2、血红素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)蛋白表达水平；另取0.3 g左右脾脏组织，准确称量重量后按照组织块重量W(g)/匀浆介质V(ml)为1/9的比例加入PBS缓冲液，以玻璃匀浆器在冰上充分研磨后进行超声破碎，5 000 r/min离心5 min，取上清待测脾脏组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)浓度。

1.4 指标测试方法

严格按照试剂盒说明书对各指标进行测试和计算。使用仪器包括Allegra 25R台式高速离心机(美国Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3酶标仪(美国雷博公司)，Pannoramic MIDI全自动数字切片扫描系统(匈牙利3D HISTECH公司)，r-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司)，722分光光度计(上海分析仪器三厂)，NR-B17CC超低温冰箱(日本松下电器)，ISO9001电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，DK-2000-Ⅲ L型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，LEICA RM2016病理切片机(德国RM公司)。

1.4.1 脾脏指数计算 脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g)×100 %

1.4.2 脾脏病理变化评价 取出固定液中的脾脏组织，经过洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋后，制成4 μm切片，HE染色，在400倍光镜下，观察脾脏组织病理变化。

1.4.3 脾脏细胞凋亡检测 采用Tunel法检测细胞凋亡。石蜡切片脱蜡至水，经修复、破膜后，将适量末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合，覆盖组织。切片平放于湿盒内，37℃ 孵育2 h后加入3 %过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min。适量converter-POD 37℃孵育30 min。洗涤，二氨基联苯胺显色，Harris苏木素染色液复染细胞核后脱水封片。试剂盒由瑞士Roche公司提供。

1.4.4 蛋白免疫组化分析 采用免疫组化法检测Nrf-2、HO-1、Bcl-2、Bax表达情况。石蜡切片脱蜡至水经抗原修复后，加入3%双氧水溶液室温避光孵育25 min后脱色洗涤3次进行血清封闭，随后加入一抗、二抗，进行二氨基联苯胺显色，Harris苏木素复染细胞核后脱水封片。抗体由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

1.4.5 H-score评分方法 采用病理切片扫描仪将每张切片内阳性细胞数量及其染色强度转化为相应数值，应用公式计算H-score。整张切片经过全视野数字扫描，根据细胞核颜色，将每个组织点的染色强度转化为像素面积并计算阳性百分比，深棕色、棕黄色、浅黄色和蓝色依次判定为强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性。H-score=(弱阳性细胞密度×1)+(中阳性细胞密度×2)+(强阳性细胞密度×3)，计算后进行组间评定。

1.4.6 其他指标测试方法 采用放射免疫法测定血清T、Cor，酶联免疫吸附法测定脾脏组织SOD活性、MDA浓度。以上试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 三组大鼠血清睾酮/皮质酮比较

血清T浓度，与C组相比，OM组呈现极显著降低(P<0.01)；与OM组相比，COM组呈现极显著升高(P<0.01)。血清Cor浓度，与C组相比，OM组呈现显著升高(P<0.01)；与OM组相比，COM组呈现极显著降低(P<0.01)。组间T/Cor与T变化趋势一致(表1)，OM组、COM组较C组下降86.33%和47.24%。

GroupnT(ng/ml)Cor(ng/ml)T/Cor(10-2)C121.82±0.7123.81±3.918.34±4.37OM110.50±0.12∗∗45.95±6.93∗∗1.14±0.44∗∗COM141.22±0.66##30.11±8.41##4.40±4.26##

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；T: Testosterone; Cor: Corticosterone

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsOM group

2.2 三组大鼠体重及脾脏指数比较

8周末大鼠体重(表2)，与C组相比，OM组呈现显著性变化(P<0.05)，COM组与OM组间无显著差异。脾脏指数，与C组相比，OM组呈现极显著性降低(P<0.01)；与OM组相比，COM组呈现显著性升高(P<0.05)。

Groupn Body weight(g)Spleen indexC12522.26±57.431.92±0.24OM11390.67±14.53∗∗1.50±0.23∗∗COM14397.47±24.361.84±0.27#

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group

**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

2.3 三组大鼠脾脏组织形态比较

光镜下观察显示(图2，见彩图页Ⅰ)，C组大鼠脾脏组织形态正常，被膜、小梁及红、白髓结构完整，界限清晰。白髓淋巴细胞丰富，生发中心明显。脾小体与脾窦结构完整、清晰可见，脾窦未见充血、扩张。OM组大鼠脾脏组织形态改变明显，红、白髓间交界模糊不清。淋巴细胞出现肿胀、细胞间间隙狭窄。血管内皮细胞出现肿胀，内皮疏松、脱落，同时出现疑似淀粉样变性、髓外造血灶及少量色素沉积。COM组大鼠脾脏组织形态损伤程度较OM组明显改善，红、白髓间交界清晰程度有明显改善，镜下未见淀粉样变性、髓外造血灶及色素沉积。

2.4 三组大鼠脾脏组织细胞凋亡水平比较

脾脏组织细胞凋亡水平，与C组相比，OM组凋亡加剧(P<0.01)；与OM组相比，COM组得到有效缓解(P<0.05)。脾脏组织Bcl-2表达，与C组相比，OM组下调显著(P<0.05)；与OM组相比，COM组上调显著(P<0.05)；Bax表达，与C组相比，OM组上调显著(P<0.05)；与OM组相比，COM组下调显著(P<0.05)。各组之间Bcl-2/Bax与Bcl-2表达变化趋势一致(表3，图3，图4，见彩图页Ⅰ)。

2.5 三组大鼠脾脏组织Nrf-2/HO-1表达水平及氧化应激指标比较

脾脏组织Nrf2表达水平，与C组相比，OM组出现下调，但无显著差异(P>0.05)；与OM组相比，COM组上调显著(P<0.05)；HO-1表达水平，与C组相比，OM组下调显著(P<0.05)；与OM组相比，COM组上调极为显著(P<0.01，表4，图5，见彩图页Ⅰ)。脾脏组织SOD活性，与C组相比，OM组呈现极显著降低(P<0.01)；与OM组相比，COM组呈现显著升高(P<0.05)；MDA浓度，与C组相比，OM组呈现极显著升高(P<0.01)；与OM组相比，COM组呈现显著降低(P<0.05，表4)。

3 讨论

机体通过有效地识别“自己”与“异己”成分，破坏和排斥以各种方式和途径进入体内的抗原物质，以及自身产生的各种损伤细胞和肿瘤细胞，充分发挥免疫机能以提高健康水平。适宜的运动有助于人体提高自身免疫机能、生活质量和健康水平已成为共识。但相关研究表明过度的运动训练易对免疫机能造成强烈的负面影响，不仅会使机体出现免疫抑制和免疫力低下，甚至对免疫系统特别是人体最大的免疫器官-脾脏造成功能和结构损伤[1,9]。

血清T/Cor比值是评价和诊断过度训练的金标准。OM组大鼠血清T/Cor比值较C组下降高达86.33%，大幅超过现有相关诊断标准[10]，说明本研究所采用的8周递增负荷游泳训练方案成功的建立了过度训练动物模型。体重是评价运动训练负荷量和强度对机体的影响程度以及机体对训练的适应情况。脾脏指数在反映脾脏发育情况的同时也可以间接的反映机体免疫水平[1]。本研究中OM组大鼠由于8周递增负荷游泳训练引发过度训练，体重及脾脏指数较C组出现极显著降低。这一结果与王雪芹[1]等人之前研究结果相一致。同时HE染色后光镜下病理诊断发现OM组大鼠脾脏组织较C组发生了明显的病理学改变。Nrf2可以作用重要调节中枢，可以在机体氧化应激反应中准确、有效地调控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达[11]。HO-1作为Nrf2下游重要的抗氧化蛋白，在应激状态下可以广泛地参与Nrf2介导的抗氧化应答过程[12]。本团队前期研究成果充分证实氧化应激所致细胞凋亡是过度训练所致脏器损伤主要发生机制之一[5-6,13]。Bcl-2与Bax间的比值变化在细胞凋亡的变化趋势中发挥重要作用[14]。本研究中与C组比较，OM组大鼠脾脏组织Nrf2表达水平虽有降低，但未出现显著性变化，SOD活性及HO-1、Bcl-2表达水平、Bcl-2/Bax比值呈现显著性降低，MDA浓度、Bax表达及细胞凋亡水平呈现显著升高。以上相关实验结果说明8周递增负荷游泳训练因运动训练负荷量与强度过大，应激强度超过大鼠自身调节能力，诱发大鼠机体氧化应激反应增强，大鼠出现过度训练综合症及免疫损伤。同时脾脏细胞凋亡加剧引发脾脏组织功能、结构损伤。其机制可能为，过度训练所致氧化应激反应加剧引发脾脏组织中Nrf2异位和ARE结构损伤，Keap1-Nrf2-ARE信号通路的转导受到影响，抗氧化能力下降，自由基代谢平衡被打破，大量的自由基无法有效清除[9]。

Tab. 3 H-score of spleen apoptosis and Bcl-2/Bax in spleen tissues of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Bcl-2: B cell lymphoma-2 protein; Bax: Bcl-2 associated X protein

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

Tab. 4 H-score of Nrf2 and HO-1, SOD activity and MDA concentration in spleen tissue of each group

C: Control group; OM: Overtraining group; COM: Curcumin + overtraining group；Nrf2: Nuclear factor erythroid 2-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase-1; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOM group

本研究中，与OM组相比，COM组大鼠血清T/C比值呈现显著升高(但较C组下降仍达 47.24%)，脾脏组织SOD活性及Nrf2、HO-1、Bcl-2表达、Bcl-2/Bax比值呈现显著增强；脾脏组织细胞凋亡水平、Bax表达、MDA浓度显著下降；脾脏组织形态明显改善；体重有所升高，但未呈现显著差异。上述实验结果充分说明了在训练过程中对大鼠进行一定剂量姜黄素干预，可以在一定程度上有效地通过延缓过度训练所致氧化应激，抑制大鼠脾脏细胞凋亡的发生，保护脾脏组织的功能和结构。其机制可能为，Nrf2表达水平的变化，可以直接影响细胞凋亡过程[13,15]。姜黄素中的酚羰基可以与Keap1中半胱氨酸残基上的巯基发生加成反应，促使Nrf2与Keap1解偶联，推动Nrf2的核转位[16]，增强Nrf2与ARE的结合，诱导HO-1表达增加[17]，缓解氧化应激反应进而影响细胞凋亡过程[18]。

综上所述，8周递增负荷游泳训练引发大鼠过度训练体内氧化应激加剧并出现，脾脏细胞凋亡加剧，脾脏组织发生病理改变及功能异常。训练期间给予姜黄素可以通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号通路，在一定程度上有效缓解过度训练引发的氧化应激，抑制大鼠脾脏细胞过度凋亡，保护脾脏组织的功能和结构，预防和延缓免疫损伤。