UPLC-MS/MS测定陈皮中的T-2毒素*

陈炜瑶,王 华,林冬杰

(梧州市食品药品检验所,广西 梧州 543002)

0 引言

T-2毒素属于A类单端孢霉烯族毒素,是单端孢霉烯族毒素中毒性最强的毒素之一.T-2毒素损害肝、皮肤、消化系统、免疫系统、神经系统等,能够使动物亚中毒甚至致死.[1]中药材陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮,采摘成熟果实,剥取果皮,晒干或低温干燥而得.[2]陈皮在炮制及储存过程中容易产生真菌毒素,《中国药典》中就有对陈皮中黄曲霉毒素的限度要求,[2]但未有T-2毒素的检测方法及限度要求,因此建立陈皮中T-2毒素的检测方法十分有必要,经查阅文献,食品中T-2毒素的检查方法主要有免疫亲和层析净化液相色谱法、ELISA法等,[3]以上方法中ELISA法需要酶标仪等设备及相应试剂盒,存在重复性差、假阳性率高等缺点,高效液相色谱法需要衍生等步骤,检测结果受到影响的因素较多,经查阅相关文献未见有用超高效液相色谱质谱联用法检测陈皮中T-2毒素的报道,该方法采液相色谱质谱联用法检测陈皮中的T-2毒素,方法简便、结果重现性好,能准确检测陈皮中T-2毒素的残留量.

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪Agilent1290-QQQ6490(美国),GR-202电子分析天平(日本).

1.2 试药

T-2毒素标准品(来源：FERMENTEK公司,批号：110728-200506);乙腈为色谱纯(天津欧姆尼基因科技有限公司);甲酸为分析纯(广东光华科技股份有限公司公司);PSA(德国CNW公司生产).

陈皮三批：市售饮片,产地：广西,批号：20180102、180307、18122807.

试验所用陈皮所有批号样品均经梧州市食品药品检验所鉴定,为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮.

2 方法

2.1 UPLC测定法色谱条件

色谱柱：UltraCore 2.5 C18 2.1×75 mm;流动相A为乙腈、流动相B为0.1%甲酸溶液,初始比例为(10∶90),使用梯度洗脱,梯度洗脱程序详见表1,柱温：35℃,流速：0.3 m L.min-1;进样量：2μL.

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution process

2.2 质谱条件

电喷雾离子源;正离子模式扫描;多反应监测(MRM)模式采集;干燥气温度：150℃;干燥气流速：18 L.min-1;雾化气压力：25 psi;鞘气温度：350℃;鞘气流速：12 L.min-1;碎裂电压：380 V;毛细管电压：3500 V.T-2毒素保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量等质谱参数见表2.

表2 T-2毒素质谱参数Tab.2 Condition parameters of mass spectrometry of T-2 Toxin

2.3 供试品溶液的制备

称取样品粉末(过二号筛)5.0 g(精确到0.1 g)于离心管中,加入20 ml乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2),混匀,旋涡混合5 min,在离心机中以8000转/min离心5 min,取上清液置含有150 mg PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)的2 ml离心管中,旋涡混合5 min,取上清液置离心机中以15000转/min离心5 min,过0.22 um滤膜,即得.

3 结果

3.1 精密度试验

取T-2毒素标准品溶液(浓度：22.5μg.ml-1),按2.1、2.2项下条件,连续进样测定峰面积6次,RSD值为0.28%(n=6).结果表明,仪器精密度良好.

3.2 线性关系考察

精确量取T-2毒素对照品储备液用乙腈配制得到浓度为1、5、15、22.5、25μg.L-1的对照品溶液,按2.1、2.2项下条件测定.进样3μL,以峰面积为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),计算其回归方程：y=531.9x+26.1,r=0.9995,表明T-2毒素在1～25μg.L-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系.

3.3 重复性试验

取陈皮样品(批号：20180102)粉末(过二号筛)按2.3方法平行制备6份供试品溶液,依据2.1、2.2条件检测T-2毒素,结果均未检出T-2毒素,RSD为0.1%,结果表明方法重复性良好.

3.4 样品测定

分别取三批陈皮样品(批号：20180102、180307、18122807)按2.3方法制备供试品溶液,按2.1、2.2项下条件测定T-2毒素残留量.结果：三批陈皮样品均未检出T-2毒素.

3.5 稳定性试验

取3.3项未检出T-2毒素的供试品溶液,按照15μg.kg-1加入T-2毒素对照品溶液,分别在0,2,4,6,8 h依据2.1、2.2条件检测T-2毒素,记录峰面积并计算RSD值,RSD为1.9%,结果表明供试品溶液在8小时内稳定性良好.

3.6 检出限试验

在陈皮(批号：20180102)粉末(过二号筛)中添加T-2毒素并按2.1、2.2项下条件检测,依据特征离子色谱峰信噪比S/N＞3为方法检测限,测得T-2毒素的检测限为2.0μg.kg-1.

图1 对照品图谱、样品图谱Fig.1 UPLC-MS/MS chromatrogram

3.7 回收率试验

在陈皮(批号：180723)粉末(过二号筛)中分别添加2μg.kg-1、10μg.kg-1、20μg.kg-1三个浓度的药物进行回收率试验,按每一个浓度做3个平行,按外标法以峰面积计算平均回收率及RSD见表3,显示T-2毒素的回收率为91.86%,RSD为2.88%,满足残留量分析的要求.

表3 T-2毒素回收率测定结果(n=9)Tab.3 Determination results of T-2 Toxin recovery(n=9)

4 讨论与小结

4.1 仪器条件优化

参考食品中液相色谱法检测T-2毒素的流动相,[3]选用乙腈-水(75∶25)作为液相色谱的流动相试验,结果T-2毒峰峰型不好,和杂质峰的不能完全分离,考虑到样品杂质干扰大,为了改善峰型,把水相由水改为0.1%的甲酸溶液,并加大了水相的比例,使用梯度洗脱,经试验,2.1项所使用的梯度条件能使T-2毒素峰型良好并能和杂质峰完全分离,流动相中使用0.1%甲酸溶液也能使T-2毒素更易于离子化,UPLC-MS/MS中获得更高的灵敏度.

在对T-2毒素优化过程中发现做全扫描时会出现加钠峰和加铵峰,加钠峰在做分析过程中容易不稳定,主要是加钠峰不容易打碎,能量过高易完全碎烈无特征,而加铵峰在精密度试验的RSD值更小,故该实验选择加铵峰作为T-2毒素的母离子.

4.2 前处理方法的选择

食品、[3]饲料[4]中高效液相色谱法检测T-2毒前处理的方法均要使用免疫亲和柱净化,其专属性强,回收率高,但存在价格昂贵、储存使用条件苛刻、保存期短等缺点.本研究采用PSA作为吸附剂,其广泛用于分析样品处理,能去除有机酸,色素和金属离子等成分,该方法中PSA可以吸附陈皮中的植物组织等各种干扰成分从而达到较好的除杂净化的目的,不但节能环保,而且极大地提高了检测效率.