肉桂精油的GC-MS成分分析及对霉菌的抑菌活性研究*

田双娥,李思明,赵 晶,廖晓迪

(广西民族博物馆,广西 南宁 530028)

肉桂为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum Trew)植物,别名玉桂、桂皮、桂枝、筒桂、桂,分布于广西、广东、海南、福建、台湾、云南.肉桂油是从植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥皮、枝、叶中提取得到的挥发油,为黄色或者棕黄色的澄清液体,有肉桂的特异香气,味甜,相对密度1.055～1.070,折光率1.602～1.614.[1]其主要化学成分为肉桂醛.不同提取方法、不同品种、不同树龄、不同产地的树皮得油率在0.44%～18.95%之间;叶、枝或枝叶的得油率在0.07%～2.90%之间;根的得油率在0.03%～0.08%之间;果实的得油率在0.72%～2.04%之间.[2]肉桂油具有广谱的抗菌作用,对细菌、酵母和霉菌均有较强的抑菌活性.[3]

霉菌是丝状真菌的俗称,在自然界中以孢子方式繁殖和传播.空气中存在大量的孢子,随着空气中的颗粒物降沉会吸附在文物表面.空气中温湿度的波动较大,在温湿度适宜的条件下,吸附在文物表面的孢子开始萌发,霉菌的生长繁殖意味着文物的劣化开始.赋存于博物馆馆藏文物展陈环境中的霉菌孢子的繁殖与博物馆中纺织品、纸制品、漆木器、毛皮革等文物的霉变劣化有着密切的关系.研发空气防霉抑菌剂,通过“洁净”文物展陈环境,对于博物馆展陈文物的微生物病害的预防具有重要意义.本文采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析了植物源提取物肉桂精油的主要活性成分,并比较了肉桂精油及其主要活性成分肉桂醛对空气来源的三种霉菌的抑菌效果.旨在为植物源空气清洁剂在博物馆中微生物病害的防治应用提供新的思路.

1 材料与方法

1.1 材料

肉桂精油,购于上海源叶生物科技有限公司,采用水蒸气蒸馏法获取.肉桂醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,含量为95%.

三株供试的霉菌菌种分别为霉菌K01,霉菌K02,霉菌K03,均分离纯化于广西民族博物馆的展厅空气中.

主要实验器皿及用品：容量250 m L的三角锥形瓶、直径90 mm的培养皿.

霉菌液体培养基和马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)均为北京索莱宝科技有限公司生产.

1.2 仪器

本研究中所用仪器如表1所示.

表1 仪器名称Tab.1 The name of the instrument

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油抑菌成分的GC-MS分析

采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对肉桂精油的成分进行分析.

气相色谱仪条件：毛细管色谱柱HP-35MS 30 m×0.25 mm,0.25μm,载气为氦气.

程序升温：初始柱温50℃,保持5 min,然后以8℃/min升温速率升至290℃,保持5 min;进样口温度280℃;载气为高纯氦气,流速1.0 m L/min;进样量为1 u L,分流比50：1.

质谱条件：EI离子源;电子能量70 eV;质量扫描范围为35～400 amu;离子源300℃,质谱接口温度为250℃.

数据库：采用标准谱库NIST进行相似度比对.

1.3.2 抑菌活性研究

1.3.2.1 孢子悬液的制备

接种霉菌后的平板放入霉菌培养箱,28℃培养4～6天后将霉菌平板取出,用移液器吸取无菌去离子水轻轻地反复冲洗平板表面的孢子,将孢子液置于恒温振荡器中(200 r/min、28℃)充分振荡30 min.使用血球计数板对振荡后的孢子悬液进行计数,最后使孢子的浓度控制在105～106 CFU/m L范围内,并将其置于4℃冰箱中保存备用.孢子悬液使用前保存不超过7天.

1.3.2.2 实验平板的制备

采用涂布平板法制备试验平板.将20 m L左右已灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倾注于无菌的培养皿中,水平静置待培养基凝固,用移液器吸取0.1 m L孢子悬液后接种于平板,然后用涂布棒涂布均匀.

1.3.2.3 抑菌活性的测定

采用琼脂平板打孔法.用无菌移液器枪头(直径为6 mm)在事先准备的试验平板上打孔,用无菌尖头镊子挑去培养基小块做成圆孔,并加入琼脂打底然后往圆孔中滴入10μL肉桂精油或肉桂醛,每个处理分别重复3次.对照孔则加入等量的无菌水.将平板放置28℃霉菌培养箱中培养2～3天后测量直径.

抑菌圈直径判定肉桂精油及肉桂醛对霉菌的抑菌活性大小.抑菌圈直径大于20 mm为极敏感,15～20 mm为高度敏感,10～15为中度敏感,6～10 mm为低度敏感;[4]抑菌圈直径小于6 mm为无抑制作用者,视为不敏感.

1.3.2.4 抑菌圈直径测量

试验平板培养好后取出,采用十字交叉法测量抑菌圈直径,以直径(cm)表示抑菌圈的大小.采用SPSS软件进行统计学分析,组间数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P＞0.05表示差异无统计学意义,P＜0.05时表示差异具有显著统计学意义,P＜0.01表示差距具有极显著统计学意义.

2 结果与分析

2.1 肉桂精油的GC-MS化学成分分析

按照上述1.3.1色谱条件,对肉桂精油进行检测分析,获得肉桂精油挥发性成分的总离子流图,见图1.由图1可知,共分离出46种化合物,经质谱库检索与标准谱图共同对照分析,共鉴定出40种化合物,占色谱总流出峰相对百分含量的98.749%.各种成分的相对质量分数按峰面积归一化法计算,结果见表2.

图1 肉桂精油GC-MS分析总离子流图谱Fig.1 The TIC of GC-MS of essential oil from Cinnamom

表2 肉桂精油的化学成分及其相对含量Tab.2 The chemical components of essential oil from Cinnamom and their relative contents

由表2可知,在GC-MS鉴定的40种化合物中,占比最多的是醛类化合物共7种占总化学成分的84.147%,酯类化合物5种占6.169%,醇类化合物6种占1.184%,烯类化合物15种占总化合物1.177%,酮类1种占0.026%,其他6种化合物(氧化石竹烯、香豆素、六氢萘、龙脑、氧化肉桂酸、异香橙烯环氧化物)共占总化学物的6.046%.相对含量较高的化学成分有肉桂醛(81.10%)、乙酸肉桂酯(5.954%)、香豆素(5.689%)、苯甲醛(1.246%),共占总化学成分含量的93.989%.

2.2 真菌对肉桂精油及肉桂醛抗真菌敏感性的研究

采用琼脂平板打孔法用抑菌圈直径评价3种受试霉菌对肉桂精油和肉桂醛的抗菌敏感性,抑菌圈直径统计结果见表3琼脂平板抑菌圈实验结果照片见图2.

表3 肉桂精油及肉桂醛对供试菌的抑菌圈直径Tab.3Antimicrobial activity(inhibition zone)of the tested molds to cinnamon oil and cinnamaldehyde

图2 肉桂及肉桂醛对供试霉菌抑菌圈照片Fig.2 Photos of inhibition zone test注：A1～A2分别为肉桂和肉桂醛对K01的抑菌圈,B1～B2分别为肉桂和肉桂醛对K02的抑菌圈,C1～C2分别为肉桂和肉桂醛对K03的抑菌圈

由表3知,肉桂精油和肉桂醛对三种受试霉菌的抑菌圈直径均大于20 mm,抑菌圈直径与抗菌活性成正比,表明三株霉菌对肉桂及肉桂醛的抑菌活性极度敏感.经琼脂孔平板打孔法抑菌圈实验比较可知,加入10μL剂量时,肉桂醛对每一种真菌的抑制作用均比肉桂精油的抑菌作用强,可能是肉桂精油中肉桂醛含量(81.100%)较低肉桂醛的缘故.

肉桂醛是一种黄色黏稠状液体,分子结构为一苯基团连接一个丙烯醛.大量的实验结果证明,肉桂醛对真菌、菌丝及毒素和细菌、芽孢都有较好的抑制效果.[5-8]可以广泛地应用于肉制品防腐,罐头杀菌,水果、蔬菜、牛奶、果汁饮料的保鲜以及新型食品包装材料等方面.肉桂醛的抑菌机理可通过多方面影响微生物的正常代谢活动起作用,且抑菌作用与肉桂醛的浓度有关,而呈现剂量-效应关系.[9-10]Shen等人[11]的电镜扫描结果直观地表明,肉桂醛导致细菌外观形态发生明显变化,对细菌的生长繁殖直接产生抑制作用;而透射电镜下观察结果表明,肉桂醛对微生物的影响不仅在外观形态,还能对其内部细胞质产生作用;透射电镜下观察结果还表明,肉桂醛对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的影响表现为使其二者分别发生细胞解体、裂解、细胞质泄露和细胞膜壁分离、细胞溶解、细胞质泄露及浓缩.研究表明,相对于细菌而言,肉桂醛对真菌的抑菌能力更强.[12]邬丽红等人[13]研究了肉桂醛对烟曲霉菌生物膜的体外作用,结果表明,肉桂醛对烟曲霉菌具有抗菌活性,亚抑菌浓度的肉桂醛对生物膜具有一定的破坏作用,其中浓度越高作用越强.张赟彬等人[14]对肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了抑菌杀菌研究,结果表明,抑杀作用机理可能是因醛基是亲水基团,易吸附于细菌或真菌表面的亲水基,从而穿入细胞壁破坏其多糖结构,最终发挥抑杀的作用.戴向荣等人[15]的研究报道,肉桂精油首先能使霉菌的细胞壁和细胞膜出现异常,再改变胞内的大分子空间结构,导致霉菌新陈代谢紊乱,从而抑制霉菌的生长.王丹等人[16]采用体外熏蒸抑菌试验研究了肉桂精油对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),链格孢菌(Alternaria alternata)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)三种主要致病菌的抑制效果,试验表明,肉桂精油对以上3种优势病原菌均有较好的抑制效果,其最小抑菌浓度(MIC)分别为60μL/L,30μL/L和30μL/L;通过扫描电子显微镜可以看出,与对照组相比,经肉桂精油处理的3种病原菌菌丝形态均受到严重破坏,发生凹陷、皱缩、粗糙等一系列变形现象.

中国肉桂油(Cassia oil(Cinnamomum cassia Blume))、肉桂皮油/油树脂(Cinnanon bark oil/oleoresin(Cinnamomaum spp.))和肉桂醛(Cinnamic aldehyde)均被我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》列入允许使用的食品天然香料和允许使用的食品用合成香料名单,[17]即在正常的剂量范围内使用肉桂精油和肉桂醛,人类的身体健康不会受到威胁.但用于博物馆的文物保护中作为杀虫抗菌防霉剂时还应考虑植物精油及活性提取物对文物本底的安全性,王克华等人[18]的研究表明,不同植物源提取物对纸张及颜料的颜色存在不同影响,香茅醛的熏蒸对纸张及颜料的颜色没有色差影响,而柠檬醛对纸张基本无色差影响、对颜料色差存在一定程度影响,肉桂醛对颜料的色差存在一定程度的影响、对纸张色差则影响较大.

肉桂油及其活性成分的天然抗菌作用使其广泛应用于食品基质中进行杀菌防腐等方面.植物精油来源广泛,还具有挥发性高、生物降解性良好、基质中残留低、对环境友好等优点,在文物保护的抑菌防霉杀虫等生物病害防治工作中备受青睐.国内多家博物馆单位如上海市博物馆、[19]南京博物院、[20]重庆中国三峡博物馆[21-22]等进行了植物源提取物防霉抑菌杀虫等方面的研究.此外,植物精油的复配能增强抑菌效果并降低各自的使用浓度.汪青青等人[23]利用分级浓度抑制指数(FIC)评价了肉桂精油和八角精油联合使用后的抗菌作用,结果表明,二者联合使用可以增强抗菌效果,降低各自的使用浓度,从而减弱用作保鲜剂时对果蔬感官特性的负面影响.杨柳等人[24]研究肉桂精油、丁香精油及其复配后的抑菌效果及在香肠中的应用,结果显示：肉桂精油和丁香精油按1∶1复配抑菌效果较好,作用时间增长,抑菌效果明显,添加精油后的香肠与普通香肠比,菌落总数和p H均较低.以酚类、醛类、醇类、酮类等为抑菌活性物质的植物源提取物均有明显的抗菌活性,在抑菌防霉方面具有开发潜力.

3 结论

本文使用气相-质谱联用仪(GC-MS)检测分析肉桂精油,共鉴定出肉桂精油的化学成分主要40种,相对含量最多的种类是醛类物质,肉桂醛是肉桂精油的最主要活性物质.其中相对含量较高的几种成分依次为肉桂醛含81.1%,乙酸肉桂酯5.954%,香豆素5.689%,苯甲醛1.246%,约占鉴定出化学成分的93.989%.

肉桂精油是一种天然的抗霉菌剂,对三种供试霉菌的琼脂平板打孔法抑菌圈实验结果表明抑菌圈直径均远大于20 mm,肉桂醛是肉桂精油的主要抗菌成分,对霉菌的抗菌效果显著.经比较实验结果可知,相同剂量(10μL)的肉桂醛抑菌效力比肉桂精油的强.结果表明,肉桂精油对霉菌具有显著的抗菌作用,其主要化学成分肉桂醛是其主要的抑菌活性成分.肉桂精油及肉桂醛作为植物源提取物应用于文物预防性保护中的霉菌和细菌污染等微生物病害防治中具有良好的发展前景.