纳米化牛樟芝对人肝癌HepG2细胞迁移侵袭能力的影响*

薛慧颖 喻兆阳★,

1．华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 湖北武汉 430030 2．华中科技大学同济医学院药学院 湖北武汉 430030

牛樟芝Antrodia camphorata（同物异名：Taiwanofungus camphoratus; Antrodia cinnamome）是一种台湾珍贵的药用真菌，又名牛樟菇、樟菇。牛樟芝腐生于台湾保育树种牛樟树的中空腐朽心材内壁或倒伏树干的表面上，具有强烈的樟树香气，属于担子菌门菌蔁纲无褶菌目多孔菌科薄孔菌属的多年生蕈菌类[1]，具有保肝、抗氧化、抗发炎、抗酒精性肝炎、抗过敏、保护神经及抗癌的活性[2]。

肝癌是最常见的恶性肿瘤，我国肝癌发病率致死率均高居第三[3]，实为国人健康的一大危害。肝癌的主要治疗方法包括放射线疗法、外科手术切除、肝脏移植等，但治疗效果大多十分有限。再者，肝癌具有较强的浸润及迁移能力，易导致预后不良，从而致使患者死亡。因此寻找高效低毒的活性化合物以对抗癌细胞转移已迫在眉睫。

近年来，纳米技术广泛应用于用于中草药的开发，研究指出中草药纳米化及药物纳米具有增加生物利用率及溶解度并且能减少药物毒性、强化药理活性等效果。多糖体及三萜类为牛樟芝的重要生理活性成分，其中主要成分多糖体及三萜类存在于牛樟芝的细胞壁中。

本课题组前期研究发现，传统的乙醇萃取无法有效释出牛樟芝三萜类与多糖体成分，影响其肿瘤治疗效果。纳米化牛樟芝子实体(以下简称纳米牛樟芝，NACF)较牛樟芝乙醇提取物(以下简称牛樟芝醇提物，ACED)具有更好抗肿瘤活性，两者对HepG2细胞IC50值分别为 225 μg·mL-1和348 μg·mL-1。但两者抗肿瘤细胞转移的活性与机制还尚不明确。

因此，本研究以人类肝癌HepG2细胞为研究对象，观察比较牛樟芝醇提物及NACF对HepG2细胞迁移、侵袭的影响差异，并探讨其可能机制，为牛樟芝纳米化研发提供进一步提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与细胞

实验所用新鲜牛樟芝由台湾兰芝生物科技有限公司提供，冷冻干燥至水分含量＜3%，应用研磨机进行研磨，得到牛樟芝子实体纳米粉末。经本实验室动态散射光分析得NACF平均粒径为22.8±2.0 nm。并将其重悬于PBS中配置成溶液，4℃保存待用。

按文献[4，5]所述，取适量牛樟芝以10倍质量的乙醇提取2次后，合并浓缩产物，以二氯甲烷/水(1∶1)分配萃取3次，所得的二氯甲烷层即牛樟芝醇提物，再用二甲基亚砜溶解，配制成相当于原药材质量浓度为1 mg·mL-1溶液保存待用。

本实验所使用的肝癌细胞HepG2细胞株由华中科技大学同济医学院药理实验室馈赠。

1.2 仪器

370型CO2培养箱（美国Termo Scientific公司），Western blot及转膜设备（美国Bio-Rad公司）；多功能显影机（Synoptics）；Synergy2多功能酶标仪（Bio-Tek）；UVP凝胶成像系统（Upland公司），；Axio observer A1荧光倒置显微镜（德国Zeiss公司）

1.3 试剂

DMEM 细胞培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国HyClone公司）；Martrigel胶（美国BD公司），BCA定量试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；E-cadherin、VEGF、β-actin抗体（美国Upstate公司）；HRP标记的山羊抗小鼠IgG（美国GE Healthcare公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 肿瘤细胞划痕实验划痕实验检测细胞的迁移能力

收集生长至对数期的HepG2细胞接种于24孔板中，每孔密度约为5×105个细胞，置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育过夜至细胞铺满皿底，用200μL移液管尖划过孔底造成垂直划痕。随后，用PBS尽量洗去划痕处细胞，分别加入含原药材浓度为200 μg·mL-1 牛樟芝醇提物与NACF的无血清培养液培养，分别在0、6h、24h于显微镜下拍照观察，试验重复3次。对每组中的划痕距离进行测量，q取平均值计算各组细胞迁移率。细胞迁移率=（初始划痕平均距离-测量时划痕平均距离）/ 初始划痕平均距离×100%

1.4.2 Transwell 实验检测细胞的侵袭能力

用无血清DMEM培养液将Matrigel胶以1∶6的比例稀释，取100μL的稀释液包被Transwell（直径6.5 mm，孔径8μm，美国康宁公司）上室。将100μL 5×104的HepG2细胞接种于含有200 μg·mL-1 牛樟芝醇提物、NACF的上层无血清培养基上层小室中。下室加入600μL含10%血清和相同浓度药物的培养基。培养24h后，用棉签去除上房中的非侵袭细胞，transwell下室侵袭中细胞用4% 多聚甲醛固定15min，然后用1%结晶紫溶液染色20 min。接着，使用蒸馏水洗去多余染料，自然风干后显微镜下各组随机选取3视野观察拍照并计数取平均值，实验重复3次。

1.4.3 Western blot检测蛋白的表达

将细胞以浓度5×105 cells /1 mL培养于6孔板中，待细胞细胞至80%～90%铺满状态后，更换为终浓度为200 μg·mL-1的牛樟芝醇提物溶液及NACF溶液37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h后收取细胞。向细胞加入适量细胞裂解液，放置冰上30min。4℃、18000×g离心10 min，收集到的上清液即为细胞蛋白质溶液，保存于-80℃冰箱待用。以BCA法测定蛋白浓度，将得到的细胞蛋白质溶液以100V，90 min条件下用10%丙烯酰胺凝胶电泳分离，之后转印到PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1 h。再用TBST洗涤3次，每次10 min。加入相应一抗并于4℃冰箱孵育过夜，然后将膜在含有0.1%吐温20 PBST中洗涤3次，再加入二抗结合1 h，最后将膜清洗3次后使用ECL进行曝光显影，以β-actin作为内参。

1.5 统计学分析

数据用均标准差表示。数据处理和统计分析采用Graphpad Prism 5.0软件进行，本研究中的各项实验均独立重复 3 次。结果以均数±标准差表示，两组间数据用双侧t检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对 HepG2 细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，空白对照组、牛樟芝醇提物组、纳米牛樟芝组6 h后细胞迁移率分别为(39.9±8.0)%、(3.6±1.4)%、(5.1±1.8)%，24 h后细胞迁移率分别为(47.8±7.0)、(17.0±5.4)、(23.9±8.0)%。与对照组相比，牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝能显著降低HepG2细胞迁移率(P ＜0.001)，且随时间延长，细胞迁移率增加。结果表明，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝可明显抑制肝癌HepG2细胞的迁移能力。（图1）

图 1 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对HepG2细胞迁移的影响

2.2 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对HepG2细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验结果显示(图2B)，牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝处理后，越过Matrigel 胶侵袭至下室的HepG2细胞数明显减少，与空白对照组[(76.8±5.8)%]相比， 牛樟芝醇提物 [(34.8±4.3)%]显著降低HepG2细胞侵袭率，而纳米牛樟芝[(34.8±4.3)%]可使HepG2细胞侵袭能力进一步降低。表明牛樟芝能够降低肝癌细胞的侵袭能力，牛樟芝纳米化后抑制效果进一步显著增强。（图 3）

图 2 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对HepG2细胞侵袭的影响

2.3 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对HepG2细胞中迁移侵袭相关蛋白表达的影响侵袭能力的影响

Western blot实验结果表明，在HepG2细胞中，牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝较空白对照组相比促进了E-cadherin的表达，且纳米牛樟芝组表达高于牛樟芝醇提物组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而血管内皮生长因子VEGF的表达，三组无明显差异，这表明牛樟芝可通过活化E-cadherin 表达从而抑制HepG2细胞增殖和侵袭，且其不依赖于VEGF信号通路。

图 3 牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对细胞迁移相关蛋白表达的影响

3 讨论

肝癌是一种恶性程度极高消化系统肿瘤，严重威胁我国人民的生命健康。肝癌的治疗效果目前极其有限，其预后不良往往是由于肝脏肿瘤的侵袭、肝内扩散及肝外转移所造成。

而中草药具有丰富活性成分，可通过多种靶点作用于肿瘤细胞，具有较好的抗肿瘤活性。牛樟芝为我国台湾特有真菌，含有多种的生理活性成分，作为一种地道药材，其治疗肝脏疾病已有两百多年的历史。牛樟芝对人肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌等细胞均有显著抗肿瘤活性[6-11]。

但这些机制多以牛樟芝萃取物或其部分纯化三萜类或多糖体为药物进行的，尚缺乏纳米化牛樟芝相关研究，因此本课题组致力于纳米化牛樟芝抗肿瘤相关研究。课题组前期研究表明牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝具有很好抑制肝癌细胞增殖与诱导其凋亡的活性。在临床上，肝脏肿瘤的侵袭、肝内扩散及肝外转移造成患者术后复发甚至死亡。

于是我们进一步研究牛樟芝对抗肿瘤细胞转移的作用，之前研究MTT实验发现牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝对HepG2细胞IC50值分别为225 μg·mL-1和348 μg·mL-1，故本实验选择200 μg·mL-1为给药浓度，使用细胞划痕及 Transwell 小室侵袭试验检测牛樟芝醇提物与纳米牛樟芝对肝癌HepG2转移能力的影响。

细胞划痕试验结果表明，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝处理HepG2细胞后，细胞迁移率显著降低， 可明显抑制肝癌HepG2细胞的迁移能力。划痕后6 h，牛樟芝醇提物组与纳米牛樟芝组细胞迁移率无明显差异，当时间延长至24h后，观察到纳米牛樟芝组较牛樟芝醇提物组相比，前者细胞迁移率高于后者，提示随时间延长纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物相比有更好的抗肿瘤迁移活性。

Transwell侵袭实验中，将细胞置于不含血清培养液中处理以避免细胞增殖对侵袭实验结果的影响。使用与细胞基质类似的Martrigel基质胶在铺于Transwell小室底部以模仿肿瘤体内微环境。本文研究发现牛樟芝醇提物组及纳米牛樟芝组穿过 Martrigel 基质胶细胞数均显著减少。并且纳米牛樟芝组细胞数少于牛樟芝醇提物组，这也提示纳米牛樟芝抗肿瘤侵袭活性优于牛樟芝醇提物。

进一步使用蛋白免疫印迹法对两者抑制肝癌细胞的机制进行研究。研究发现， 牛樟芝醇提物、纳米牛樟芝可上调E-cadherin的表达，但对VEGF的表达无明显调节作用。

由此我们认为在HepG2细胞中，牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝可能主要通过上调E-cadherin的表达水平来发挥抑制细胞迁移及侵袭作用，但具体的调控机制仍不清楚，有待进一步研究。今后我们也将探究通过动物实验继续研究牛樟芝醇提物及纳米牛樟芝对体内肿瘤转移能力的影响。

综上所述，本研究证明牛樟芝产物纳米牛樟芝及牛樟芝醇提物均可抑制肝癌细胞侵袭和迁移，且纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物相比能显著增加对E-cadherin的表达，具有更好抗肝癌细胞转移活性。相对于传统萃取方式，我们认为本实验牛樟芝样品纳米牛樟芝较牛樟芝醇提物而言完整保留了牛樟芝全部生理活性成分，且纳米化后可提高样品的溶解度、表面积以及生物可用率，促进肿瘤细胞吸收从而增加了其对癌细胞抗肿瘤活性。牛樟芝可作为肝癌治疗良好的潜在药物，本文为中药纳米化研发提供新的依据。