超声辅助-酶解协同作用 提取红枣渣膳食纤维及其促消化作用

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(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046; 2.新疆农业科学院生物质能源研究所,新疆乌鲁木齐 830091; 3.韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关 512005; 4.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州 450002)

红枣具有很高的营养价值,主要产品有枣汁、枣酒和罐头等[1]。在加工生产过程中,80%以上的枣渣被废弃,不但浪费原料,同时也造成了环境的污染。枣渣中含有丰富的膳食纤维,一般分为水溶性膳食纤维(SDF)和水不溶性膳食纤维(IDF)两大类[2],水溶性膳食纤维可以排除体内有害金属离子、减少血液中的胆固醇水平,调节血糖水平,从而降低心脏病的危险[3-4];水不溶性膳食纤维能够促进大肠蠕动,使食物在大肠里停留的时间缩短,以防治便秘,并降低大量细菌把食物转变成有毒物质的机会,同时也能将食物里已经存在的有毒物质进行稀释,减少大肠受到伤害的机会,更好地预防直肠癌的发生[5-6]。

国内外提取膳食纤维常用的方法有化学提取法[7]、酶提取法[8]、物理化学提取法[9]、膜分离法[10]和发酵法[11]。化学提取法工艺简单、成本低,但膳食纤维提取率较低、并且容易造成化学溶剂残留[12]。酶法提取红枣膳食纤维,可获得较纯的膳食纤维,但是单独的酶法制备成本较高[13]。膜分离法是利用膜分离技术,将分子量大小不同的膳食纤维分离提取,使用此法的缺点是不能制备不溶性膳食纤维,而且此法对设备要求较高[14]。发酵法生产的膳食纤维色泽、质地、气味和分散程度均优于化学法,比化学提取法得到的膳食纤维有较高的持水力和得率,但是对实验条件要求苛刻[15]。超声波具有空化作用、机械振动和热效应等特性,能够破碎被提取原料和细胞壁,加速有效成分的溶出和扩散[16],利用超声波辅助酶法提取膳食纤维可以提高酶解效率,缩短耗时[17]。

本研究以提取多糖后的红枣渣为原料,优化超声-酶解联用技术提取红枣渣膳食纤维,分析超声-酶解联用提取方法对红枣渣膳食纤维提取效果的影响,同时以红枣渣膳食纤维为基料,小麦粉为辅料制作高膳食纤维食用粉,进行动物实验,研究红枣渣膳食纤维食用粉促消化作用。探究更有效的利用资源工艺,延长枣产品加工的产业链,提高枣的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣渣(新疆骏枣枣渣,提取多糖以后的枣渣) 刀郎枣业开发有限公司;复方地芬诺酯 新乡市常乐制药有限责任公司;活性炭粉 天津永晟精细化工有限公司;阿拉伯树胶 上海山浦化工有限公司;α-淀粉酶(3700 U/g) 北京奥博星生物技术有限责任公司;碱性蛋白酶(200 U/mg) 北京奥博星生物技术有限责任公司;浓硝酸、双氧水、碘化钾、硫代硫酸钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、氯化钡等 均为分析纯,天津市大茂化学试剂厂。

Anke TDL-5-A离心机 安捷伦科技有限公司;PHS-3C实验室pH计 上海虹益仪器仪表有限公司;KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FW-100高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂;AL-104分析天平 Mettler-Toledo Group;DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;Anke TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器;控温消煮炉 上海洪纪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验用鼠饲养 SPF级昆明种小白鼠100只,雌雄各半,订购体重14～16 g;繁育单位:新疆实验动物研究中心;实验动物生产许可证号:SCXK(X2011-0001);实验动物许可证号:65000200000093、65000200000097。实验动物饲养环境:实验动物饲养间温度20～26 ℃,日温差≤3 ℃,相对湿度40%～60%;动物饲养于标准盒内,每盒单性别5只,保持盒内环境清洁干燥,每日添加饲料和饮水,自由取食。

1.2.2 超声-酶解协同作用提取红枣渣膳食纤维工艺流程 红枣渣烘干→中药粉碎机粉碎→过筛网(60目)→称量→加去离子水→调节合适pH→加α-淀粉酶→控温超声→离心分离→滤渣调节合适的pH和温度→蛋白酶酶解→灭酶灭菌→醇洗→烘箱烘干→再次粉碎→得到膳食纤维产品[13]

操作要点:准确称取一定量的红枣渣,以一定料液比加入去离子水,调节pH为6.0,分别加入一定质量分数的α-淀粉酶,放于超声波清洗器中,在一定的超声温度,超声功率240 W条件下,酶解一定时间,取出后,3000 r/min离心15 min,调节滤渣pH至9.6,再调温度至50 ℃,加入0.1%碱性蛋白酶酶解3.0 h,用高压灭菌锅灭菌灭酶后在加入85%的无水乙醇进行浸泡洗涤,60 ℃烘干,烘干后的膳食纤维用中药粉碎机粉碎均匀,过60目的筛网,得到膳食纤维产品。

1.2.3 超声-酶解协同作用提取红枣渣膳食纤维单因素实验

1.2.3.1 加酶量对红枣渣膳食纤维提取率的影响 准确称取红枣渣10.0 g,于5个干净的锥形瓶中加100 mL去离子水,调节pH为6.0,分别加入1%、1.5%、2%、2.5%、3%(m/m)的α-淀粉酶,在50 ℃下超声处理,在超声温度50 ℃,超声功率240 W条件下超声酶解40 min,取出后,3000 r/min离心15 min,调节滤渣浆液pH至9.6,再调温度至50 ℃,加入碱性蛋白酶酶解3.0 h,醇洗,60 ℃烘干,考察不同加酶量对红枣渣膳食纤维提取率的影响。

1.2.3.2 料液比对红枣渣膳食纤维提取率的影响 准确称取红枣渣10.0 g,于5个干净的锥形瓶中,分别按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL加入去离子水,调节pH6.0,加入2%的α-淀粉酶,其余操作同1.2.3.1。考察不同料液比对红枣渣膳食纤维提取率的影响。

1.2.3.3 超声时间对红枣渣膳食纤维提取率的影响 准确称取红枣渣10.0 g,于5个干净的锥形瓶中,加100 mL去离子水,调节pH为6.0,加入2%的α-淀粉酶,在50 ℃下超声处理,考察超声时间分别为25、30、35、40、45 min对红枣渣膳食纤维提取率的影响,其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 超声温度对红枣渣膳食纤维提取率的影响 准确称取红枣渣10.0 g,于5个干净的锥形瓶中,加100 mL去离子水,调节pH为6.0,加入2%的α-淀粉酶,超声处理35 min,考察超声温度分别为40、50、60、70、80 ℃时对红枣渣膳食纤维提取率的影响,其余操作同1.2.3.1。

1.2.4 响应面试验优化提取工艺 在单因素实验的基础上,应用Box-Behnken的中心组合设计原理,以加酶量(A)、料液比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)4个因素为自变量,每个因素取三水平以红枣渣膳食纤维提取率为响应值,进行试验设计,因素水平设计见表1。

表1 响应面法分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.5 红枣渣膳食纤维食用粉促消化作用试验

1.2.5.1 样品制备 以红枣渣膳食纤维为基料,小麦粉为辅料,基辅比按照重量比1∶2.5 (g/g)配比[18]。利用双螺杆挤压技术对混合粉进行改性。采用双螺杆挤压工艺条件:去离子水质量分数27.5%,挤压温度164 ℃,主机频率34 Hz,制备获得高膳食纤维食用粉,再经超微粉碎,粉碎时间10.53 min,填充量303.54 g,入磨水分4.95%[19],在此条件下得出的最小D50为16.57 μm。将所制得的膳食纤维食用粉溶解,做小鼠灌胃实验。

1.2.5.2 小鼠小肠运动实验 SPF级昆明种小白鼠50只,体重18～22 g,实验前24 h各组动物禁食,自由饮水。按性别随机分为空白对照、模型对照、红枣渣膳食纤维食用粉低剂量(L)、红枣渣膳食纤维食用粉中剂量(M)、红枣渣膳食纤维食用粉高剂量(H)5组,每组10只,雌雄各半。根据表2给药剂量连续给药7 d,1次/d。给药第1、4、7 d称量体重。

表2 小鼠灌胃红枣渣膳食纤维食用粉对促消化功能的影响实验给药剂量(n=10)Table 2 Mice were gavaged with red jujube residue ediable powder on promoting digestion function influence experimental dosage(n=10)

墨汁的配制:准确称取阿拉伯树胶100 g,加入去离子水800 mL,煮沸至溶液透明,称取活性炭粉50 g,加入上述溶液中煮沸3次,待溶液凉后加水定容到1000 mL。

第7 d给药后,实验动物禁食不禁水16 h,空白对照组给予等体积蒸馏水,模型对照组和各给药组分别给予复方地芬诺酯混悬液(5 mg/kg),30 min后,红枣渣膳食纤维食用粉各剂量组分别灌胃给予含受试样品(1.3、2.7、5.3 g/kg)的墨汁,空白对照组和模型对照组给予等体积墨汁。再25 min后,颈椎脱臼处死小鼠,打开腹腔,取自幽门端至回盲部肠管,直线状平铺于托盘,测量肠管总长度为“小肠总长度”,自幽门端至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。利用复方地芬诺酯混悬液建立小鼠的便秘模是一种非特异性便秘模型,它利用药物的收敛作用导致便秘,此模型制备简单易行,成功率高。

墨汁推进率计算如式(1):

式(1)

式中:l为墨汁推进长度,cm;L为小肠总长度,cm。

1.2.5.3 小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定 将SPF级昆明种小白鼠按照1.2.5.2相同方法造模,给药第1、4、7 d称量体重。第7 d给药后,实验动物禁食不禁水16 h,空白对照组给予等体积蒸馏水,模型对照组和各给药组分别给予复方地芬诺酯混悬液(10 mg/kg),30 min后,红枣渣膳食纤维食用粉各剂量组分别灌胃给予含受试样品(1.3、2.7、5.3 g/kg)的墨汁,空白对照组和模型对照组给予等体积墨汁。实验动物单笼饲养,正常饮水进食。自给予墨汁时开始计时,记录每只动物首粒排黑便时间、6 h排黑便粒数和重量。

1.2.6 红枣渣膳食纤维提取率及纯度计算 红枣渣总膳食纤维的测定按NY/T 1594-2008水果中总膳食纤维的测定非酶-重量法[20]进行;不溶性膳食纤维分析按《GB 5009.88-2014 食品中膳食纤维的测定》[21]进行。以红枣渣膳食纤维提取率为考察指标。红枣渣膳食纤维提取率计算如式(2)。

式(2)

式中:m为提取所得红枣渣膳食纤维的质量,g;M为样品红枣渣的质量,g。

膳食纤维纯度计算公式如式(3)。

式(3)

式中:X为试样中粗纤维的含量;G为残余物的质量,g;m为称取样品的质量,g。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 超声-酶解协同作用提取红枣渣膳食纤维单因素实验

如图1A,当酶的添加量在1%～2%浓度范围内红枣渣膳食纤维提取率显著增加,超出该范围，随着酶用量的增加，红枣渣膳食纤维提取率没有明显的变化,这可能是由于酶用量较少时,底物浓度超过酶的浓度;酶用量过高时,底物被酶饱和。因此,选择最适加酶量为2%。

图1 超声-酶解联用提取红枣渣膳食纤维单因素试验Fig.1 Single factor experiment of ultrasonic-enzyme-assisted extraction of dietary fiber from red jujube residue注:A～D分别为加酶量、料液比、超声时间和超声温度对红枣渣膳食纤维提取率的影响。

由图1B可知,当料液比从1∶4～1∶10 g/mL变化时,红枣渣膳食纤维提取率增加,并且在1∶10 g/mL时达到最大,当继续增加料液比时红枣渣膳食纤维提取率减小,料液比过低和过高都不利于植物细胞中酶活性位点的运动[22]。考虑到溶剂的用量可以增加食品工业中的生产成本,因此选择料液比在1∶10 g/mL。

如图1C可知,随着超声时间的增加,红枣渣膳食纤维的提取率呈现先升高后降低的趋势。在35 min时红枣渣膳食纤维的提取率达到最大值,超过35 min时出现下降趋势。这可能是由于超声波的机械振动和空化作用,可加快分子振动速度,提高酶解效率[23];但当超声时间过长时,由于超声波的空化作用将某些大分子物质打碎成小分子物质[24],造成红枣渣膳食纤维水解,降低红枣渣膳食纤维的提取率。因此,提取红枣渣膳食纤维的最适超声时间为35 min。

酶的活性不仅取决于pH,还依赖于提取温度[25]。由图1D可知,在40～60 ℃范围内,随着温度的升高红枣渣膳食纤维提取率增加,当提取温度高于60 ℃,红枣渣膳食纤维提取率不断降低。这可能是由于提取温度较高时会导致酶活性增加,但提取温度过高时会引起酶失活[26]。因此,红枣渣膳食纤维的最适提取温度为60 ℃。

2.2 超声-酶解协同作用提取红枣渣膳食纤维响应面法优化

在单因素实验结果的基础上,采用响应面法优化超声-酶解联用法提取红枣渣膳食纤维的工艺条件,试验结果见表3。

表3 响应面分析实验设计与结果Table 3 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

由表4的方差分析可知,该模型F值较高(F=23.63)而p值非常低(p<0.0001),表明所得的模型为显著并且可以充分代表参数之间的关系;失拟项的F值和p值分别为4.32和0.0856,这表明它相对于纯误差不具有显著性,任何组合的变量都可以用模型方程预测膳食纤维的提取率。失拟项p=0.0856在p<0.05水平上差异不显著,表明该模型具有较高拟合度,实验误差小,说明该模型具有实际应用意义[27]。加酶量(A)和超声温度(D)对红枣渣膳食纤维提取率影响极显著(p<0.01),加酶量是对红枣渣膳食纤维提取率影响最大的因素。AC、AD、BD、A2、B2、C2、D2对提取率影响均极显著(p<0.01)。红枣渣膳食纤维提取率与各因素变量的二次方程模型为:

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

Y=64.26-4.73A+1.02B+0.81C+2.67D-0.15AB+3.26AC-4.00AD+0.30BC+4.11BD+0.42CD-4.17A2-8.23B2-5.25C2-3.29D2

通过模型方程所做的三维响应面图以及与之对应的等高线图能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应面值的影响。等高线的形状可以反映出交互作用的强弱。椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反。若响应曲面图形坡度陡峭,表明响应值对于操作条件的改变非常敏感,若曲面图形坡度相对平缓,则表明操作条件的改变对响应值影响较小[28]。由图2响应面结果可知,加酶量与超声时间、加酶量与超声温度、超声温度与料液比之间交互作用显著,其余各组间交互作用不显著,与方差分析表结果一致。

图2 超声-酶解联用法提取红枣渣膳食纤维工艺优化响应面因素交互作用Fig.2 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction rate of dietary fiber

根据所建立的模型进行工艺条件的优化组合,得到最佳工艺条件为加酶量1.54%,料液比1∶10.42 g/mL,超声时间33.58 min,超声温度69.49 ℃,此时红枣渣膳食纤维提取率预测值为68.92%。为了操作方便,以加酶量1.5%、料液比1∶10 g/mL、超声时间35 min、超声温度70 ℃,进行3次平行实验验证。结果显示在该工艺条件下,红枣渣膳食纤维提取率为69.31%±0.91%,纯度为67.6%±2.995%,证实该模型可用于红枣渣膳食纤维的提取工艺的理论预测。

2.3 红枣渣中膳食纤维可溶性膳食纤维与不溶性膳食纤维含量分析结果

从图3可以看出,红枣渣中总膳食纤维含量在26.5%左右,其中不溶性膳食纤维含量高达21.7%,可溶性膳食纤维含量为4.8%。不溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维的比例是217∶48。可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维有着不同的生理功能。其中,可溶性膳食纤维具有提高葡萄糖耐受力、降低胆固醇水平等生理功效;不溶性膳食纤维则更多地发挥着增加粪便的体积,促进肠道蠕动,从而具有防止便秘、腹泻、憩室炎等功能。美国供给量专家委员会推荐膳食纤维的摄入比例以70%～75%为不可溶性膳食纤维,25%～30%为可溶性膳食纤维为宜[29]。

图3 红枣渣膳食纤维定量分析Fig.3 Quantitative analysis of dietary fiber of red jujube residue

2.4 红枣渣膳食纤维食用粉促消化作用

2.4.1 小鼠小肠运动实验 小鼠进驻后分层随机分为5组,由表5可知,组间体重均无统计学差异(p>0.05);实验分层随机分组后连续灌胃红枣渣膳食纤维食用粉7 d,第1、4、7 d各给药组和模型对照组与空白对照组比较,体重均无统计学差异(p>0.05)。说明红枣渣膳食纤维食用粉对各组小鼠体重无明显影响。

表5 小鼠灌胃红枣渣膳食纤维食用粉对小肠运动试验动物体重的影响(g,n=10)Table 5 Effect of dietary fiber powder from jujube residue on body weight of mice in small intestinal exercise test(g,n=10)

由表6可见,小鼠连续灌胃红枣渣膳食纤维食用粉7 d,模型对照组与空白对照组比较,小肠墨汁推进长度减少、墨汁推进率减少,结果差异极显著(p<0.01),即复方地芬诺酯造模成功。红枣渣膳食纤维食用粉各给药组与模型对照组比较,小肠墨汁推进长度增加、墨汁推进率增加,结果均有统计学差异(p<0.01)。各组小肠总长(幽门至回盲瓣)间比较,结果均无显著性差异(p>0.05)。各剂量组相比,中剂量组红枣渣膳食纤维食用粉小肠墨汁推进长度增加、墨汁推进率最高、小肠总长最长。说明红枣渣膳食纤维食用粉对小鼠口服复方地芬诺酯造模引起的小肠推进能力障碍有明显的改善作用。其中,红枣渣膳食纤维食用粉中剂量组效果最佳。

表6 小鼠灌胃红枣渣膳食纤维食用粉对小肠墨汁推进长度、墨汁清除率的影响(n=10)Table 6 Effect of dietary fiber powder from jujube residue on small intestinal ink propulsion length and ink clearance in mice(n=10)

2.5 红枣渣膳食纤维食用粉对小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的影响

由表7可知小鼠进驻后分层随机分为5组,组间体重无统计学差异(p>0.05);实验分层随机分组后连续灌胃红枣渣膳食纤维食用粉7 d,第1、4、7 d各给药组和模型对照组与空白对照组比较,体重均无统计学差异(p>0.05)。

表7 小鼠灌胃红枣渣膳食纤维食用粉对促排便试验动物体重的影响(g,n=10)Table 7 Effects of dietary fiber powder from jujube residue on body weight of mice in defecation-promoting experiment(g,n=10)

由表8可知小鼠连续灌胃红枣渣膳食纤维食用粉7 d,模型对照组与空白对照组比较,给墨汁后6 h内黑便排出时间增加、黑便粒数减少、黑便重量减少,结果均有统计学差异(p<0.01)。

表8 小鼠灌胃红枣渣膳食纤维食用粉对促排便时间、粪便粒数和粪便重量的影响(n=10)Table 8 Effects of dietary fiber powder from jujube residue on defecation time,stool grain number and fecal weight of mice(n=10)

红枣渣膳食纤维食用粉各给药组与模型对照组比较,给墨汁后6 h内黑便排出时间减少,结果差异均极显著(p<0.01);红枣渣膳食纤维食用粉高剂量给药组与模型对照组比较,给墨汁后6 h内排出黑便粒数增加,结果差异显著(p<0.05),红枣渣膳食纤维食用粉中、低剂量给药组与模型对照组比较,给墨汁后6 h内排出黑便粒数无统计学意义(p>0.05);红枣渣膳食纤维食用粉高、中剂量给药组与模型对照组比较,给墨汁后6 h内排出黑便重量增加,结果均有统计学意义(高剂量p<0.01,中剂量p<0.05)。说明红枣渣膳食纤维食用粉对小鼠口服复方地芬诺酯造模引起的粪便排出时间延长有明显改善作用,而中剂量、高剂量组给药对地芬诺酯造模引起的排便重量减少有明显改善作用。

3 结论

通过超声-酶法联用提取红枣渣膳食纤维,得到提取最优工艺为:超声功率为240 W,加酶量1.5%,料液比1∶10 g/mL,超声时间35 min,超声温度70 ℃,在此条件下红枣渣膳食纤维提取率最高达到69.31%±0.91%。超声-酶法联用提取得到的红枣渣总膳食纤维含量在26.5%左右,其中不溶性膳食纤维含量高达21.7%,可溶性膳食纤维含量为4.8%。不溶性膳食纤维和可溶性膳食纤维的比例是217∶48。实验提取得到的红枣渣膳食纤维不溶性膳食纤维含量高,人体摄入后可增加粪便的体积,促进肠道蠕动,可有效有防止便秘、腹泻、憩室炎等疾病。动物模型实验研究发现,通过连续灌胃的实验组小鼠,在体重上没有显著性差异(p>0.05),说明红枣渣膳食纤维食用粉不会对小鼠体重产生明显的影响。小肠运动实验结果显示,连续灌胃7 d的实验组小鼠与对照组相比较,小肠墨汁推进长度和墨汁推进率增加极显著(p<0.01)。各剂量组相比,中剂量组红枣渣膳食纤维食用粉小肠墨汁推进长度增加、墨汁推进率最高、小肠总长最长。说明红枣渣膳食纤维食用粉对小鼠口服复方地芬诺酯造模引起的小肠推进能力障碍有明显的改善作用。其中,红枣渣膳食纤维食用粉中剂量组效果最佳。小鼠排便实验发现,小鼠连续灌胃红枣渣膳食纤维食用粉7 d后,与空白对照组相比,给墨汁后6 h内黑便排出时间增加、黑便粒数减少、黑便重量减少(p<0.01),与模型对照组比较,给墨汁后6 h内黑便排出时间减少(p<0.01);各剂量组相比,高剂量组和中剂量组给墨汁后6 h内排出黑便重量均表现出增加(高剂量p<0.01,中剂量p<0.05),对地芬诺酯造模引起的排便重量减少有明显改善作用。因此,红枣渣膳食纤维食用粉中剂量和高剂量给药对小鼠有显著(p<0.05)的促进消化和排便的作用。