三种植物源增殖性底物 对嗜酸乳杆菌发酵及蛋白表达的影响

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(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134; 2.河北一然生物科技有限公司,河北石家庄 050899)

目前,有关益生菌的发酵生产以及功能评价一直是生物发酵领域的研究主题,使用较多的是乳杆菌属和双歧杆菌属。日本、欧洲、澳大利亚、美国等国的益生菌制品在功能性食品市场份额上占有很大的比重。现如今益生菌产品开发的新方向还包括:减肥降脂食品、孕婴食品、宇航食品、运动食品、减压食品、过敏人群食品、减少损害食品[1]等。研究表明,益生菌能改善宿主微生态平衡、发挥有益作用并产生确切的健康疗效,对宿主健康具有非常重要的作用,因此在生物工程、工农业、食品安全等领域[2]均有广泛应用,也是研究的热点。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)是目前乳酸菌家族中研究与开发比较广泛的益生菌之一,是人体肠道中重要的微生物,被视为第三代乳酸发酵剂菌种[3]。报道指出,L.acidophilus具有平衡肠道微生物区系、调节肠道功能紊乱、增强机体肠粘膜屏障、调节肠道内免疫系统、抗癌抗肿瘤的作用[4-5]。L.acidophilusCICC6005 属于革兰氏G+,无芽孢杆菌科的乳杆菌属,以短链、单个、成对等形式存在于人及一些动物肠道中,其最适生长温度为35～38 ℃,最适pH为5.5～6.2[6]，具有耐酸、耐胆汁酸盐的特性,能通过胃进入肠道,代谢乳糖产生乳酸、细菌素等[7]物质;因L.acidophilusCICC6005的主要代谢产物是有机酸,可降低环境中的氧化还原电位和pH,抑制酸性细菌和需氧细菌生长,这是该菌发挥益生作用的主要原因[8]。因此,对其进行更深一步的研究是非常必要的。

已有研究表明,益生菌分泌的一些代谢产物具有免疫调节作用,能够促进肠道稳态,在保健食品的开发研究中具有显著的开发潜力[9]。Schlee等[10]研究发现，L.acidophilusPZ 1138、发酵乳杆菌PZ 1162,干酪乳杆菌干酪亚种LMGP.17806混合益生菌分泌的胞外蛋白可以通过激活NF-kB和MAPK信号通路诱导上皮细胞抗菌肽hβD-2的分泌。Bernaro等[11]研究发现，植物乳杆菌分泌的肽类物质可以诱导人类肠道树突细胞产生白细胞介素-10(interleukin,IL-10),IL-10对炎症、自身免疫疾病的预防和肠道稳态的维持有很重要的作用。

目前本实验室对L.acidophilusCICC6005也进行了一定的研究,贾彦等[12-13]研究了不同质量浓度的杜仲水提液添加到MRS培养基中,旨在探究不同质量浓度的杜仲水提液对L.acidophilusCICC6005菌株增殖情况及对发酵过程中胞外和胞内蛋白含量变化的影响,并对其蛋白组分进行分析。结果显示添加适宜质量浓度的杜仲水提液对L.acidophilusCICC6005菌株的增殖起到了一定的促进作用,并对其发酵产物组成产生了一定的影响。在此研究基础上为更好地探究和利用L.actobacillusCICC6005的生物学功能,解析该菌表现生物学功能的活性成分,本研究进一步从基础培养基(TJA)出发,通过添加不同的增殖性底物,筛选并优化促进L.actobacillusCICC6005菌株增殖的组合促进剂;同时重点分析鉴定该组合促进剂对发酵L.actobacillusCICC6005的胞内和胞外蛋白质的作用,探讨对该菌表达蛋白质的影响,对阐述该菌的益生功能具有科学意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄、苹果、土豆 天津市水木天成店物美超市,体型饱满,无病虫害;嗜酸乳杆菌CICC6005(L.acidophilusCICC6005) 本实验室保藏菌种;MRS肉汤培养基、TJA培养基 购自北京奥博星生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS) 上海威奥科技有限公司;TEMED 碧云天生物技术研究所;葡聚糖凝胶SephadexG-100 北京索莱宝科技有限公司;30%丙烯酰胺 Solarbio公司;1.0 mol/L Tris-HClSolarbio公司;过硫酸铵 天津市风船化学试剂科技有限公司;考马斯亮蓝R-250 Sigma公司;细菌总蛋白抽提试剂盒 上海生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司。

MuLtiskan MK3Thermo酶标仪 Thermo 公司;3-18KS高速冷冻离心机 Sigma公司;TD5Z低速离心机 Aida公司;DYCZ-24DN迷你双垂直电泳槽 北京六一仪器厂;24DN制胶器 北京六一仪器厂;DYY-2C电泳仪 北京六一仪器厂;T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;OHG-9073BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;XW-80A微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器有限公司;HYG-Ⅲ廻转式恒温摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司;CXG-1电脑恒温层析柜 上海泸西分析仪器厂有限公司;BT-100恒流泵 上海泸西分析仪器厂有限公司;1H1D-5电脑紫外检测仪 上海泸西分析仪器厂有限公司;BS-100A自动部分收集器 上海泸西分析仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 番茄汁、苹果汁、土豆汁的制备 番茄汁的制备:将新鲜番茄切碎(勿捣碎),置于4 ℃冰箱中8～12 h至到有上清液析出,纱布过滤即得;苹果汁、土豆汁的制备:将新鲜苹果、土豆洗净,切成边长为0.5 cm左右的小丁,各称取150 g,加水煮沸15 min,定容至500 mL,过滤取上清。将以上汁液(作为植物源增殖性底物)分装,121 ℃,灭菌15 min,4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2L.acidophilusCICC6005种子液的配制 以TJA培养基作为基础培养基,将冻存的L.acidophilusCICC6005菌种于固体斜面培养基上活化24～36 h,再转接于MRS活化24 h,以此作为种子液。

1.2.3 单因素实验设计 前期通过预实验确定了L.acidophilusCICC6005菌株在TJA培养基上的生长情况,在此基础上,将番茄汁、苹果汁、土豆汁分别稀释成0%、2%、4%、6%、8%的浓度,分别取2 mL逐个加入48 mL TJA液体培养基中,调节pH为6.2,为5组实验组,另取2 mL蒸馏水添加到48 mL TJA液体培养基中作为对照组,以上5组分别做3个平行实验,121 ℃灭菌15 min,实验组和对照组均按2%接种量接入L.acidophilusCICC6005菌株,在37 ℃下培养24 h后,得到的菌悬液用平板计数法测定活菌数[14]。

1.2.4 正交试验设计 在单因素实验的基础上,对番茄汁、土豆汁、苹果汁进行3因素3水平正交试验[15-16]见表1。在600 nm[17]下测定悬菌液的OD值(OD值与活菌数在同一介质溶液中呈线性相关,为避免计算存在的误差,正交试验结果以OD600 nm下测定的吸光度为指标),得出影响条件的主次顺序及各因素对反应的影响程度,选取最优组合。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthognal experiment

1.2.5L.acidophilusCICC6005菌体胞外蛋白和胞内蛋白的提取 胞内蛋白的提取:将以上最优组合发酵液于4 ℃离心,10000 r/min,10 min,分离上清液和菌体。收集移出的上清液,并于4 ℃条件下保存。沉淀的菌体用2 mL预冷的 0.01 mol/mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)振荡洗涤,10000 r/min离心10 min,除去上清液,沉淀即为胞内蛋白,将其存放于-20 ℃条件下保存[18-19]。

胞外蛋白的提取:采用TCA-丙酮沉淀法浓缩胞外蛋白。上清液与TCA以体积比4∶1混合,4 ℃条件下处理60 min,4 ℃条件下14000 r/min离心20 min,弃去上清液。用预冷丙酮溶液反复洗去蛋白沉淀中的TCA,4 ℃条件下14000 r/min离心5 min弃上清液,待丙酮完全挥发,用0.01 mol/L PBS溶解沉淀,与-20 ℃条件下存放[20-21]。蛋白质浓度的测定采用BCA法,具体操作按照试剂盒说明书。

对照组蛋白为1.2.3对照组培养后所得悬菌液提取的粗蛋白。

1.2.6L.acidophilusCICC6005胞内和胞外蛋白的纯化 采用凝胶过滤层析法将Sephadex G-100凝胶柱(1.6 cm×50 cm)用0.05 moL/L的PBS缓冲液(pH7.4)平衡好溶胀好后,取胞外或胞内蛋白2 mL进行上样,然后用缓冲液以1 mL/min的流速进行洗脱,用紫外检测仪在波长280 nm处检测,并用核酸、蛋白检测系统收集信号,收集各峰组分;用PEG 10000包埋浓缩[22-23]。

1.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白质的分子量大小 聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据不同的蛋白质具有不同的电荷,能产生不同的迁移率,从而将蛋白质分离成若干条谱带。SDS能将分子间和分子内的氢键和疏水键断裂,以一定的比例与蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质不再受电荷的影响,只与分子大小有关,当分子量在15～200 ku之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系[24]。凝胶电泳迁移率是根据SDS-PAGE凝胶电泳结果图,以蛋白质Marker中各蛋白迀移率X作为横坐标,以标准蛋白质分子量的对数为纵坐标作图,根据标准曲线得出各峰的蛋白分子量大小。将培养好的L.acidophilusCICC6005 的胞内胞外蛋白粗提液及两组胞内蛋白、胞外蛋白组进行SDS-PAGE 凝胶电泳分析,判断胞外胞内蛋白组分分子量大小。

1.3 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 不同浓度增殖性底物对L. acidophilus CICC6005活菌数的影响

本研究以TJA为基础培养基考察L.acidophilusCICC6005的生长状况,经平板计数,L.acidophilusCICC6005活菌数可达5.38×109CFU/mL。随后考察不同增殖性底物对L.acidophilusCICC6005生长的影响。

在增殖培养基中，添加的增殖性底物中含有丰富的营养成分[25]，会对菌株生长产生一定的影响，不同增殖性底物对L.acidophilusCICC6005生长的影响如图1所示。由图1可知，随着增殖性底物浓度的增大，活菌数均呈现先升高后降低的趋势。当番茄汁浓度为4%～6%时，活菌数较高，对L.acidophilusCICC6005的生长促进作用较大；当番茄汁浓度为8%时，对菌的生长产生了明显的抑制作用，这是由于番茄汁添加量的增大，其含有的糖类物质浓度相应增加，导致L.acidophilusCICC6005生存环境中的渗透压升高，从而抑制了菌的增殖[26]。在苹果汁浓度为4%时，活菌数达到最高，对L.acidophilusCICC6005的生长促进作用达到最大。当苹果汁浓度过大(8%)时，对菌的生长产生抑制作用，苹果汁中含有多糖、维生素以及有机酸类物质[27]，随着苹果汁浓度的增大，使培养基中多糖、维生素含量偏高，增大培养基的渗透压，抑制了L.acidophilusCICC6005的生长。当土豆汁浓度为2%～4%时，对菌的生长促进作用也较大。土豆中富含淀粉、氨基酸、维生素以及无机盐，可为L.acidophilusCICC6005提供生长所需的碳源、氮源、以及生长因子[28]。土豆汁浓度过高时，同样使活菌数下降，对L.acidophilusCICC6005的生长不利。综上，选择的较优番茄汁浓度为5%，苹果汁浓度为4%，土豆汁浓度为3%。

图1 不同浓度增殖性底物对L. acidophilus CICC6005活菌数的影响Fig.1 Effect of different concentration of growth promoting substance on the growth of L. acidophilus CICC6005

2.2 正交试验结果

按照正交试验表1设计,考察三种植物源增殖性底物的组合对L.acidophilusCICC6005在TJA培养基共培养所表现的对菌体增殖能力的影响,结果见表2所示。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

由K值分析比较可得出，较优试验组合为A2B2C1，即番茄汁浓度5%、土豆汁浓度3%、苹果汁浓度2%，此时测得OD值为0.694，L.acidophilusCICC6005活菌数达2.31×1010CFU/mL。由R值分析比较可得，RC>RB>RA，即：影响L.acidophilusCICC6005生长浓度各因素的主次顺序为：C(番茄汁浓度)、B(土豆汁浓度)、A(苹果汁浓度)。

2.3 L.acidophilus CICC6005胞内和胞外蛋白分析鉴定结果

2.3.1L.acidophilusCICC6005发酵液胞内和胞外全蛋白分析 按方法1.2.5所述,分离提取发酵液和菌体的全蛋白,均按照BCA试剂盒法测定发酵液和菌体的蛋白质含量。采用SDS-PAGE进行分析,结果见图2所示。

图2 L. acidophilus CICC6005胞内胞外 全蛋白SDS-PAGE电泳结果Fig.2 The result of SDS-PAGE electrophoresis of intracellular and extracellular protein of L. acidophilus CICC6005 注:M：Marker;1：对照组; 2：未纯化的胞内全蛋白;3:未纯化的胞外全蛋白。

由图2可看出,L.acidophilusCICC6005胞外全蛋白对应的泳带中包含6条主条带,分别位于80、75、63、48、40、30 ku附近,未纯化的胞内全蛋白与对照组相比,泳带明显增多,说明植物源增殖性底物对L.acidophilusCICC6005菌体蛋白表达具有一定的促进作用。未纯化的胞外全蛋白与对照组相比,泳带也明显增多的原因,这可能是由于菌体产蛋白酶含量降低有关。

2.3.2L.acidophilusCICC6005菌体胞外胞内蛋白的纯化 依据1.2.6所建立的方法对含有植物源增殖性底物发酵生产的发酵液和菌体的蛋白进行纯化,凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的,凝胶过滤填料中含有大量微孔,只容许缓冲液及小分子量蛋白质通过,而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外[29]。

采用最优试验组合A3B2C3的粗提蛋白进行纯化,所得层析图谱如图3、图4所示。由于菌体胞内和胞外蛋白含量的不同,所以在对蛋白进行层析时胞内蛋白和胞外蛋白层析图谱上均出现两个明显的洗脱峰,将其命名为a、b、c、d四个峰，用BCA法和通过标准曲线测定a、b、c、d四个峰的蛋白质质量浓度,依次为2.144、0.744、2.394、4.644 mg/mL。对各峰分别进行收集,对收集的各峰组分进行透析、浓缩备用。

图3 L. acidophilus CICC6005胞内蛋白层析图谱Fig.3 Intracellular protein chromatography of L. acidophilus CICC6005注:图中a、b分别指凝胶层析Sephadex G-100 分离获得的菌体内的两个主要蛋白质峰。

图4 L. acidophilus CICC6005胞外蛋白层析图谱Fig.4 Extracellular protein chromatography of L. acidophilus CICC6005注:图中c、d分别指凝胶层析Sephadex G-100 分离获得的发酵液中的两个主要蛋白质峰。

2.3.3 SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定各峰组分蛋白质的分子量大小 对最优试验组合A3B2C3培养L.acidophilusCICC6005 的胞内胞外蛋白粗提液及两组胞内蛋白(a、b)、胞外蛋白组进行(c、d)SDS-PAGE凝胶电泳分析,判断胞外胞内蛋白组分分子量大小,结果如图5。由图5可知,胞内蛋白a峰的泳带集中在48～90 ku附近,b峰在18 ku附近处有一条清晰的电泳条带;胞外蛋白c峰在分子量18、35、48、64 ku附近有较清晰的条带,d峰在37、48 ku附近处有清晰泳带。相比未纯化的胞内胞外全蛋白,当TJA营养培养基中加入植物源增殖性底物时,L.acidophilusCICC6005各组分蛋白条带较清晰,差异明显,说明经Sephadex G-100凝胶层析后也实现了较好的分离。

图5 L. acidophilus CICC6005胞外胞内 蛋白SDS-PAGE电泳结果Fig.5 The results of SDS-PAGE electrophoresis of extracellular and intracellular protein of L. acidophilus CICC6005

2.3.4 凝胶电泳迁移率标准曲线 标准曲线如图6,得到回归方程为y=-1.3029x+2.3431(R2=0.977)根据标准曲线得出各峰的蛋白分子量大小,即胞内蛋白的分子量为a峰59 ku、b峰17 ku;胞外蛋白的分子量为c峰66 ku、d峰35 ku。

图6 凝胶电泳迁移率标准曲线Fig.6 Standard curve of gel electrophoresis mobility

3 讨论

益生菌是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物,其能够调节胃肠道失调,在抗癌抗肿瘤、预防肥胖、抗过敏、提高免疫功能等有良好的功效[30]。番茄、土豆、苹果是我们日常生活所涉及的食材,对人体肠道微生物的菌群消长有着较为密切关系。

李辉等[31]研究了黄瓜、番茄、胡萝卜天然提取汁对嗜酸乳杆菌HS112菌种生长的影响。由单因素实验结果得出,黄瓜汁的5%、番茄汁的6%、胡萝卜汁为8%为HS112菌种的最佳刺激体积分数。刘奕玮等[32]研究了蓝莓汁及其提取物对嗜酸乳杆菌NCFM体外生长的影响,蓝莓多糖添加量为100 mg/L时能较好的促进菌株NCFM的生长,37 ℃培养24 h,细胞活菌数可达到8.32×108CFU/mL。王烈喜等[33]研究了番茄汁对嗜酸乳杆菌发酵乳的影响,结果表明:番茄汁可以刺激嗜酸乳杆菌的生长,在冷藏的过程中,所有添加番茄汁的发酵乳中嗜酸乳杆菌的活菌数显著高于纯样品。

基于该研究方面的早期报道,本实验探究植物源增殖性底物对L.acidophilusCICC6005菌体的发酵增殖作用也获得了类似的研究结果。本研究以L.acidophilusCICC6005为研究对象,基于人类日常摄入多种果蔬食材的习惯和特点,以TJA作为基础培养基,通过添加适量的番茄汁、土豆汁、苹果汁发酵培养L.acidophilusCICC6005,对该菌生物量影响是明显的,在这样的发酵培养基组成的条件下,L.acidophilusCICC6005菌体浓度达到2.31×1010CFU/mL的水平。本文重点研究并解析发酵菌体蛋白质表达水平的变化,为阐述和揭示该菌的生物学功能奠定基础;研究结果显示,三种增殖性底物添加的浓度番茄汁5%、土豆汁3%、苹果汁2%的组合比例的条件下,对L.acidophilusCICC6005的胞外蛋白与胞内蛋白的表达水平产生明显影响,电泳图谱的鉴定显示,蛋白质的电泳条带增多;同时也较明显地增强了胞内蛋白的表达量。经进一步鉴定胞外两种主要的蛋白组分分子质量为66、35 ku,胞内两种主要蛋白组分分子质量为59、17 ku。研究结果提示，三种植物源增殖性底物番茄汁、土豆汁、苹果汁作用于L.acidophilusCICC6005，不仅对该菌具有较好的增殖作用,也对该菌体蛋白质的表达量水平具有明显的促进作用。然而,在该研究条件下L.acidophilusCICC6005表达的蛋白结构及其表现的生物学功能尚需进一步研究鉴定,将对阐述该发酵条件下L.acidophilusCICC6005菌体及发酵液的生物学功能奠定基础。

4 结论

本文通过研究不同浓度的植物源增殖性底物对L.acidophilusCICC6005 生长量的影响,通过正交试验确定最优组合为:番茄汁5%、土豆汁3%、苹果汁2%,发酵液的菌浓为2.31×1010CFU/mL。利用SDS-PAGE的电泳技术鉴定菌体和发酵液中表达全蛋白质的图谱显示,L.acidophilusCICC6005在该营养条件下表达蛋白的数量有明显的增加,经分离纯化胞外及胞内蛋白均得到两个不同的峰,胞内蛋白的分子量为59、17 ku;胞外蛋白的分子量为66、35 ku;其蛋白质质量浓度依次为2.144、0.744、2.394、4.644 mg/mL。研究对深入阐述益生菌表达的蛋白组分以及其发挥的功效具有一定科学价值。