花生醋浸过程中蛋白质、多肽含量变化及其抗氧化性的研究

，，，， *

(1.镇江恒顺生物工程有限公司,江苏 镇江 212021；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院 植物源功能食品北京市重点实验室，北京 100083)

近代医学发现，用醋浸泡的食物有防治疾病的作用，特别是对高血压、冠心病、糖尿病、肥胖症、感冒、干咳及延缓衰老有特殊作用，因而醋方在近年来成为大众青睐的养生之道[1]。自由基理论的提出让人类认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关[2]。而抗氧化剂可以清除体内过多的自由基，因而人通过适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基的水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病[3]。国内外研究证实多种不同来源的多肽成分具有抗氧化活性，如玉米多肽、大米多肽、罗非鱼多肽、鱼精多肽等[4-7]。魏振承等[8]发现花生多肽饮品具有抗氧化和缓解体力疲劳的作用。陈贵堂等[9]通过开展花生多肽对氧化损伤模型小鼠抗氧化作用的研究发现花生多肽有较强的抗氧化功能性。在相关实例性报道中指出食用醋泡花生有利于降低血压，降血脂，软化血管，减少胆固醇累积，有预防心血管疾病的功效。而这些功效的实现与抗氧化性息息相关。然而目前对于醋泡花生的研究主要集中于营养成分分析方面，但对于醋花生功能特性的相关研究较少。因而本文通过探究醋泡花生抗氧化性的变化以及醋浸过程中蛋白质和多肽含量的变化，以期为醋泡花生在功能食品方面的实际应用和进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生花生、老陈醋、香醋：镇江恒顺生物工程有限公司提供；DPPH、Tris： Sigma-Aldrich试剂公司；还原型谷胱甘肽(GR)： 上海雅吉生物科技有限公司；无水乙醇、盐酸、硼酸、氢氧化钠、标准滴定盐酸、98%浓硫酸、硫酸钾、无水硫酸铜、三氯乙酸、抗坏血酸：均为分析纯，北京化工厂。

pHS-3C型pH计 上海三信仪表厂；HR2870型粉碎机 飞利浦家庭电器有限公司；V-5000型分光光度计、ALC-210.2型分析天平 北京恺欣科技发展有限公司；GL-20G-II型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；FD-1A-55型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Biorab Model 550型酶标仪、康宁透明96孔板 Bio-Rad生命医学产品有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 醋花生制作

本实验按照醋500 g、花生300 g的比例分别泡制了2种醋花生：陈醋、生花生、香醋+生花生。

1.2.2 样品处理

干燥：在花生浸泡的第0，3，5，7，10，13天分别取样60 g，于40 ℃鼓风干燥至恒重，-20 ℃保存。 脱脂：取干燥好的样品20 g，粉碎。加入适量正己烷，摇瓶振荡1.5 h，6000 r/min离心5 min，重复以上操作直至上清液澄清透明。弃去上清液，待固体风干24 h后于-80 ℃冻藏保存。

1.2.3 醋液pH测定

取醋泡花生浸泡第0，3，5，7，10，13天的醋液，使用pHS-3C型pH计分别测定其pH值。

1.2.4 粗蛋白含量测定

参照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质含量的测定》(附录一)中第一法凯氏定氮法，根据实验实际情况略有改动。称取固体试样0.1 g，移入干燥的消化管中。加入硫酸铜与硫酸钾混合试剂(1∶8.75)1.5 g及15 mL 98%浓硫酸，置于通风橱内的消化炉中消化至液体呈蓝绿色并澄清透明。取下放冷后，至凯氏定氮仪进行测定。每个样品做3组平行测定。

1.2.5 多肽含量测定

参考刁文睿等[10]的方法，根据实际情况略有改动。用5% TCA水溶液依次配制0，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的还原型谷胱甘肽溶液于10 mL容量瓶中，然后分别取6.0 mL标准溶液，加入4.0 mL双缩脲试剂，混匀，静置10 min。2000 r/min离心10 min，在540 nm下测定吸光值。以多肽质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。称取0.3～0.5 g样品，加入25 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)提取1 h，4 ℃，8000 r/min离心15 min，取上清液。上清液加入等体积的12%三氯乙酸，混合后静置30 min，4 ℃，8000 r/min离心15 min，沉淀大分子蛋白质，所得上清液即为肽提取液。取6.0 mL上清液置于另一试管中，加入双缩脲试剂4.0 mL，混匀，静置10 min。2000 r/min离心10 min，在540 nm下测定吸光值。每个样品做3组平行测定。

1.2.6 DPPH自由基清除法测定抗氧化性

分别配制4，8，12，16，20 μg/mL的抗坏血酸溶液，用酶标仪测定其清除率，然后以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制Vc当量标准曲线。取脱脂花生2 g，加入25 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，置磁力搅拌器上，搅拌提取0.5 h后，4 ℃ 8000 r/min 离心15 min，再重复以上过程1次，合并2次上清液为多肽提取液。将提取液置于-80 ℃冰箱冻藏至完全冻住后，置冻干机冻干。在517 nm下，分别测定2 mL DPPH无水乙醇溶液(0.01 mmol/L)与2 mL样品溶剂混合液充分振荡反应静置30 min后的吸光值A0，2 mL DPPH无水乙醇溶液(0.01 mmol/L)与2 mL样品混合液充分振荡反应静置30 min的后吸光值A1，2 mL无水乙醇溶液(0.1 mmol/L)与2 mL样品混合液充分振荡反应静置30 min后吸光值的A2。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。每个样品做3组平行测定。

2 结果与分析

2.1 花生醋浸过程中醋液pH的变化

图1 醋花生醋浸过程中食醋pH的变化Fig.1 The pH changes of vinegar soaked peanuts

由图1可知，2种醋花生在泡制过程中，醋液pH值呈现相同的变化规律。在浸泡0～3天的过程中，pH值升高显著，随着浸泡时间的延长，pH值略有下降后维持稳定。在醋豆的相关研究中，豆子经过醋浸泡后，含酸量变化也呈现相似规律。由于醋酸的作用，大豆中的大分子降解，致使总蛋白和可溶性蛋白含量降低，而可溶性糖和还原糖含量显著增加。水解产物溶解到醋液中，留存在醋大豆中的蛋白质、氨基酸、总糖、还原糖和总黄酮含量均相应降低[11]。因而推断花生醋浸过程中醋液pH值的上升可能是由于大分子蛋白在食醋酸性条件下发生水解，生成了小分子的花生多肽。同时有部分水解产物溶解到醋液中，从而引起醋液pH值的变化。另一方面，大分子蛋白经过水解后，溶于醋液中的小分子多肽因其酸性残基和碱性残基的暴露也会影响醋液pH值的变化[12]。

2.2 花生醋浸过程中蛋白质及多肽含量的变化

图2 花生醋浸过程中粗蛋白含量变化Fig.2 The crude protein content changes of vinegar soaked peanuts

由图2可知，随着浸泡时间的延长，粗蛋白含量下降。在浸泡到13天时，用香醋浸泡的花生粗蛋白含量下降了18.03%，而陈醋浸泡的花生粗蛋白含量下降了22.64%。

图3 花生醋浸过程中多肽含量变化Fig.3 The polypeptide content changes of vinegar soaked peanuts

通过实验，得到多肽含量测定的标准曲线公式为y=0.5163x+0.0002(R2=0.9996)。由图3可知，醋花生多肽含量的变化先增加后趋于稳定。其中，用陈醋浸泡的花生在第7天时，多肽含量达到峰值，含量为(5.38±0.07) g/kg。而香醋浸泡的花生，多肽含量在第10天达到峰值(3.83±0.11) g/kg。多肽含量达到峰值后，略有下降后趋于平缓。江晨等[13]对花生多肽的溶解性进行了研究，发现花生多肽在pH为4.5(等电点)时溶解性最小，在pH值2～5时，溶解性随着pH值的升高而降低，在pH值5～12时，溶解性随着pH值的升高而升高，花生肽在pH值2～12的范围内都保持着较高的溶解性(≥87%)。在本研究中的pH测定实验发现，2种醋花生醋液pH值均保持在4.5以下，pH值峰值接近4.5。因而，花生在醋液浸泡前期，醋花生中多肽含量增多。随着浸泡时间延长，醋液pH值升高，花生多肽的溶解性降低，直至pH接近等电点4.5时，花生多肽不再继续溶解。在浸泡后期，醋花生的多肽含量在达到峰值后略微下降而后趋于稳定。

2.3 花生醋浸过程中抗氧化性变化

试验测得，Vc当量标准曲线y=4.7297x+2.8562(R2=0.9941)，经数据处理得到花生醋浸过程中Tris-HCl提取物抗氧化性的变化，见图4。

图4 花生醋浸过程中Tris-HCl提取物抗氧化性的变化Fig.4 The antioxidant activity changes of Tris-HCl extract of vinegar soaked peanuts

由图4可知，花生经过醋浸后，Tris-HCl提取物的抗氧化性提高，且在浸泡前3天时增长显著，浸泡后期趋于平缓。2种食醋浸泡的花生抗氧化能力变化没有明显的差异。实验结果显示醋花生抗氧化性的变化与多肽含量变化都呈增长趋势，且在浸泡前期增长显著。花生中含有大量的功能活性成分，其中花生仁含脂肪50%左右，含蛋白质24%～36%，除了富含油脂和蛋白质之外，花生仁还富含植物固醇、类黄酮、维生素和微量矿物质等[14]。在本研究中，已经对花生进行脱脂处理，因而脱脂花生中的主要营养成分为蛋白质。结合本研究中花生多肽含量变化结果可知，花生经过食醋浸泡，花生蛋白水解为小分子多肽，已有报道花生多肽具有清除自由基和抗氧化作用，且pH值在3～7时，对DPPH自由基的清除效果较好(>80%)[15],花生多肽可以被Tris-HCl提取出来，因而推断花生醋浸过程中其抗氧化性变化可能与多肽含量的变化有相关关系。花生经过食醋浸泡后，在浸泡前期，花生多肽含量显著增多，因而其多肽抗氧化性也增长显著。根据实验结果还发现，花生在浸泡至第3天时，抗氧化性已达到峰值并趋于稳定，但其多肽含量仍在继续增多，在浸泡7天后才达到峰值。分析其原因可能为以下三点：第一，目前发现的抗氧化肽，它们的氨基酸残基数多小于20，分子量均较小[16]。醋液提供的酸性环境，使得一部分具有抗氧化活性的小分子花生多肽溶解于醋液中，因而即使醋花生多肽含量在增多，但其抗氧化性增长却减缓。第二，王戈莎[17]发现肽浓度较低时，粳米多肽与DPPH的电子能够很好地结合，因而随着肽浓度的增大，Protese N水解所得粳米多肽的DPPH清除率也相应增大。当肽的浓度增大至70%时，粳米多肽和DPPH的电子结合接近于饱和，使得清除率的增长速度减慢。因而推断在本研究中，醋花生多肽抗氧化性的变化也与花生多肽与DPPH电子结合度有关，随着花生多肽浓度增大，花生多肽与DPPH电子结合接近于饱和，因而其抗氧化性增长减缓并趋于稳定。第三，食醋中富含有机酸，于丽娜等[18]发现加入柠檬酸和酒石酸会对花生抗氧化能力有较大影响，其中柠檬酸的加入会使花生抗氧化肽清除DPPH自由基的效果下降。因而推断在花生醋浸过程中，食醋中柠檬酸、酒石酸等有机酸对花生抗氧化肽的供电能力造成了影响，导致清除DPPH自由基效果下降。

相关研究表明肽的抗氧化性不仅和分子量相关，还和肽的氨基酸组成和序列相关。有研究指出，抗氧化活性肽的作用机制与疏水性氨基酸、抗氧化氨基酸和酸性氨基酸及其构象密切相关。本实验获得的结果的机制还需要进一步研究。

3 结论

上述研究结果表明，花生醋浸过程中，由于食醋中酸性物质的作用，大分子蛋白降解为具有抗氧化活性的小分子功能肽，因而醋花生的抗氧化性提高。随着浸泡时间的延长，由于可水解的大分子蛋白减少，溶解于醋液中的花生多肽增多，同时花生多肽与DPPH电子的结合度趋于饱和以及醋液中酒石酸、柠檬酸等有机酸的影响，使得在浸泡后期的醋花生多肽抗氧化能力的增长趋于稳定。本研究结果对进一步探究醋泡花生的抗氧化性提供了研究思路及参考。在今后的实验研究中也可以将醋泡花生的醋液作为研究对象，探究其营养成分及抗氧化能力的变化，以期为更进一步开发醋花生这一保健食品提供更全面的参考依据。