山葵浸提液消除食品中亚硝酸盐的研究

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(成都大学 药学与生物工程学院，成都 610106)

亚硝酸盐是日常食物中常见的一种致癌物质前体，其进入人体后能与次级胺结合,形成亚硝胺,诱发消化系统癌变,对人体健康造成威胁[1]。亚硝胺是一类化学致癌物质,因此阻断亚硝胺合成或消除亚硝酸胺的前体是防治癌病产生的有效途径之一[2，3]。我国食品卫生法规定了腌制品中亚硝酸盐含量应小于30 mg/kg[4，5]。日常饮食中许多物质中均存在超标的亚硝酸盐：如不新鲜或过度施用氮肥的蔬菜、不新鲜的水果、腊肉、泡菜、酱腌菜等[6，7]。实际上，如果人们在植物种植过程中采用正确的种植方法，同时消费者正确选择食物，亚硝酸盐对人体造成的影响会减小很多。比如菜农适量施加氮肥，消费者不去购买不新鲜的蔬菜水果，尽量少吃腊肉、酱腌菜等含亚硝酸盐高的食物，但是在现实生活中却很难做到。因此，寻找一个能快速消除亚硝酸盐并且不会带入新的有害物质的材料具有非常重要的现实意义。山葵植物体自身含有丰富的Vc、异硫氰酸酯类化合物和硒等物质[8]，其中已知的Vc、硒物质能有效抑制亚硝胺的合成[9]。同时山葵本身具有独特风味，能对食物起到很好的调味作用。本文叙述了通过条件优化寻找山葵浸提液消除亚硝酸盐的最优条件，同时将山葵浸提液用于部分食品中亚硝酸盐的消除，效果明显。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

山葵根茎：广元市生物科技玺府公司；对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、NaNO2、硼砂、硫酸锌、亚铁氰化钾：均为分析纯；腊肉(腌制4天，保存1个月)、酸菜(腌制3天)、腌萝卜(腌制4天)：均为自制；维生素C：成都市科龙化工试剂厂。

752型紫外-可见分光光度计 上海达平仪器有限公司；PHS-3C型酸度计 成都锐新仪器有限公司；HH-4S水浴锅；FA1204B/0.0001 g电子分析天平；高速组织搅拌器。

1.2 标准曲线的绘制

分别吸取不同量的亚硝酸钠标准溶液于比色管中构成不同亚硝酸盐浓度，加入4 g/L对氨基苯磺酸2 mL，摇匀静止3 min，加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺，加水定容至刻度，静止15 min。于波长538 nm处测定吸光度，得标准曲线为y=0.61289x+0.01271,r=0.99926，线性范围为0～1.4 μg/mL。

1.3 腊肉、酸菜、腌制萝卜3种样品处理

腊肉、酸菜、腌制萝卜3种样品捣碎，各取200 g于烧杯中，加水200 mL制成匀浆备用。

1.4 山葵浸提液的制备

山葵根茎洗净、晾干、捣碎后，取25 g，用300 mL 40%乙醇转入500 mL锥形瓶中，在20 ℃下浸提40 min后用滤纸过滤，将滤液放置在15 ℃黑暗泡沫箱中备用。

1.5 亚硝酸盐含量的测定

取40 mL制备的样品于比色管中，以下步骤按标准曲线绘制操作。于波长538 nm处测吸光度，从标准曲线上查得亚硝酸盐的含量。

1.6 亚硝酸盐清除率的测定

准确吸取5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL,移入50 mL比色管中,加15 mL山葵浸提液,调pH,摇匀,反应15 min后,加2 mL 0.4%对氨基苯磺酸,摇匀,静置4 min,再加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，摇匀，定容至刻度,静止15 min，取上清液,于538 nm处测吸光度值。

NaNO2清除率=[A-(B-C)]/A。

式中：A为亚硝酸钠OD值；B为实验组OD值；C为山葵浸提液OD值。

1.7 山葵浸提液对亚硝酸盐最佳清除条件的探究

通过单因素试验确定山葵浸提液对亚硝酸盐清除率的影响因素,之后选取主要因素,设置不同水平,通过正交试验确定山葵浸提液对亚硝酸盐的最佳清除条件。

1.8 样品中亚硝酸盐清除率的测定

分别取2份腊肉、酸菜、腌制萝卜匀浆，其中1份加入山葵浸提液，调节反应液pH值为3.2，反应30 min，另1份做空白，然后将匀浆全部转入250 mL容量瓶中，加入6 mL饱和硼砂溶液，摇匀，再加入30%硫酸锌溶液2 mL和15%亚铁氰化钾溶液2 mL，振摇3 min，定容至刻度，摇匀，静置，过滤，按1.6操作方法比色，计算山葵浸提液对食品中亚硝酸盐的清除率。

1.9 不同pH反应介质中Vc对亚硝酸盐的消除测定

取1.75 g Vc溶于1000 mL 40%乙醇溶液中，其浓度为1.75 mg/L，取15 mL，与2.5 mL亚硝酸钠在不同pH介质下反应，显色测定，计算其消除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

设置反应介质pH值、山葵浸提液用量、浸提温度、浸提时间、反应时间和亚硝酸盐量6个因素来研究山葵浸提液清除亚硝酸盐的影响。

2.1.1 反应介质pH 值对亚硝酸盐清除的影响

分别取5份NaNO2溶液，加入20 ℃下浸提40 min山葵浸提液15 mL，用白醋调节反应液为不同pH值，分别测定亚硝酸盐的含量，计算清除率，见表1。

表1 反应介质pH值对亚硝酸盐清除的影响

由表1可知，在不同pH反应介质中，随着pH的增大，山葵浸提液对亚硝酸盐的清除率先增大后减小，在pH为3.5的亚硝酸盐清除率最大，为87.51%，原因是山葵浸提液中对亚硝酸盐有清除作用的各物质在pH达到3.5时综合清除率达到最大。

2.1.2 山葵浸提液用量对亚硝酸盐清除的影响

分别取15支50 mL容量的比色管，每份加 NaNO2溶液2.5 mL, 加入山葵浸提液0，5，10，15，20 mL，用白醋调节pH为3.5，反应15 min,通过显色测定其吸光度，计算亚硝酸盐清除率见表2。

表2 山葵浸提液用量对亚硝酸盐清除的影响

由表2可知，随着山葵浸提液用量的增加，在相同时间下不同试样中亚硝酸盐的清除率逐渐增加，但在5～10 mL变化明显，而之后变化较小。山葵浸提液作为反应物其底物浓度增大会加速化学反应中对另一种反应物亚硝酸盐的消耗，其理论上亚硝酸盐清除率会接近100%。

2.1.3 不同温度下获得的山葵浸提液对亚硝酸盐清除的影响

山葵浸提液的制备：分别取9份捣碎的山葵根茎每份5 g于250 mL锥形瓶中，加入40%乙醇100 mL在0，5，10，15，20，25，30，35，40 ℃下浸提40 min，过滤后通过显色测定其吸光度，计算亚硝酸盐清除率，见表3。

表3 不同温度条件下获得的山葵浸提液对NaNO2清除的影响

由表3可知，山葵浸提液的浸提过程中，温度对亚硝酸盐的清除影响很大。总体趋势是浸提温度越高其清除率越低。温度在0～5 ℃消除率下降明显，在5～35 ℃消除率变化不大，当温度大于35 ℃后，清除率又明显降低。原因可能是山葵中对亚硝酸盐有清除作用的物质不稳定，温度升高导致其被破坏。目前已知山葵浸提液中对亚硝酸盐有清除作用的物质Vc是不稳定物质，其对热不稳定，容易氧化和被热破坏[10]，温度越高其浸提率越低[11,12]。另外，山葵中含有异硫氰酸酯类化合物，其挥发与水解速度随着温度升高而加快[13]。

2.1.4 不同浸提时间的山葵浸提液对亚硝酸盐清除的影响

山葵浸提液的制备：分别取7份捣碎的山葵根茎，每份5 g于250 mL锥形瓶中，加入40%乙醇100 mL在20 ℃下浸提10，20，30，40，50，60，70 min，过滤后通过显色测定其吸光度，计算亚硝酸盐清除率见表4。

表4 山葵浸提时间对亚硝酸盐清除的影响

由表4可知，山葵浸提液在50 min时对亚硝酸盐的清除率达到最大，其原因可能是植物浸提的过程分为扩散、渗透、溶解几个阶段[14]。山葵组织细胞被破碎后相应物质溶解需要一定的时间。在浸提时间达到50 min时清除率达到最大，山葵中有些清除亚硝酸盐的物质不稳定，如:Vc与山葵精油类物质均是在溶液中不稳定的物质，长时间暴露在光照下和溶于水中被逐渐消耗，从而导致浸提时间加长，亚硝酸盐消除率降低。

2.1.5 不同作用时间对亚硝酸盐清除的影响

分别取15支50 mL容量的比色管，每份加5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL, 各加入山葵浸提液15 mL，用白醋调节pH为3.5,分别反应5,10,15,20,25,30 min，通过显色测定其吸光度，计算亚硝酸盐清除率，见表5。

表5 反应时间对亚硝酸盐消除的影响

由表5可知，随着反应时间的增加，亚硝酸盐的清除率增大。其原因是化学反应需要时间，在反应未达平衡之前反应一直正向进行，一直消耗反应物亚硝酸盐。在理论情况下会一直上升，之后逐渐变缓至水平，清除率不会出现两边低中间高的峰值。同时在15 min后消除率增长变慢，说明前15 min大部分反应物已经被消耗。

2.1.6 不同亚硝酸盐量对亚硝酸盐清除率与清除量的影响

显色与测量：实验组取6支50 mL容量的比色管，每份加 5 μg/mL 亚硝酸盐溶液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mL, 加入山葵浸提液15 mL,用白醋调节pH为3.5，反应15 min，通过显色测定其吸光度，计算亚硝酸盐清除率见表6。

表6 亚硝酸盐量对亚硝酸盐清除量和清除率的影响

由表6可知，在山葵液用量不变的情况下，亚硝酸盐加入量为1 mL时清除率最大为100%，随着反应物中亚硝酸盐含量的增加，清除率逐渐降低。而亚硝酸盐清除量刚好相反，其呈现先增加后逐渐保持不变的状态。在加入亚硝酸盐量达到3 mL之后，亚硝酸盐的消除量基本上保持不变，说明15 mL山葵浸提液清除的亚硝酸盐为13.43 μg。

2.2 山葵浸提液对亚硝酸盐最佳清除条件的测定

选取山葵浸提温度、浸提时间、反应液 pH 值3个主要因素采用 L9(34)正交表进行正交试验以确定山葵对亚硝酸盐的最佳清除条件。

表7 浸提温度、提取时间、pH正交试验

由表7可知，在几种因素各自的梯度下，因素C(pH)为最重要的因素，因素A(温度)次之，最后是因素B(提取时间)。随机变量极差为1.14，与提取时间极差1.87相差不大，说明提取时间在50 min上下波动幅度为5 min时消除效果已很稳定。通过正交试验得出最佳控制条件为：提取温度0 ℃、提取时间55 min、反应介质pH 3.2。

2.3 山葵浸提液清除食品中亚硝酸盐

2.3.1 山葵浸提液对腊肉亚硝酸盐的清除

测得腊肉中亚硝酸盐含量为35.67 mg/kg,用山葵液处理后测得亚硝酸盐含量为5.32 mg/kg，清除率为85.09%。

2.3.2 山葵浸提液对白菜腌制的酸菜中亚硝酸盐的清除

测得酸菜中亚硝酸盐含量为58.23 mg/kg,用山葵浸提液处理后测得亚硝酸盐含量为9.62 mg/kg，清除率为83.48%。

2.3.3 山葵浸提液对腌制萝卜中亚硝酸盐的清除

测得腌制萝卜中亚硝酸盐含量为12.25 mg/kg，用山葵浸提液处理后测得亚硝酸盐含量为0.32 mg/kg,清除率为97.39%。

2.4 Vc对亚硝酸盐的清除研究

表8 Vc对亚硝酸盐的清除影响

由表8可知， Vc对亚硝酸盐有清除作用，其中Vc在不同pH下清除亚硝酸盐的变化趋势与山葵在不同pH下清除亚硝酸盐的变化相似。同时根据山葵中成分含量参照已知山葵根茎含有大量Vc，Vc在酸性条件下稳定但在碱性条件下不稳定，易被分解，Vc的配制浓度也与山葵中Vc浓度相对应，因此山葵浸提液对亚硝酸盐的清除作用可能与Vc关系较大。

3 讨论

影响山葵浸提液对亚硝酸盐清除的主要因素有pH、山葵浸提温度、山葵浸提时间。本实验进行条件优化，得出最适反应pH为3.2，浸提温度为0 ℃，浸提时间为55 min，在一定条件下亚硝酸盐用量越少，山葵浸提液用量越多，且反应时间越长，消除效率越高，但最终会达到最大值，即清除率不再随着山葵浸提液用量的增加与作用时间的延长而变化。同时，将山葵浸提液运用到食品中对亚硝酸盐的清除，其效果显著。

由于山葵作为一种植物，其物质成分太过复杂，本研究只能推导降解亚硝酸盐的物质有Vc，并不能准确给出降解亚硝酸盐的主导物质。同时，本实验山葵的最佳浸提温度为0 ℃，而朱凤妹在《大蒜浸提液清除酱腌菜中亚硝酸盐的研究》中提到大蒜浸提液的最佳浸提温度为80 ℃，这2种材料浸提温度相差很大，说明2种植物材料清除亚硝酸盐的物质必定有较大差异。本实验对山葵浸提液清除亚硝酸盐的条件优化中，其最适pH酸性较强，食品运用过程中可根据实际情况选择较弱的酸性条件，同时选用本研究优化的其他最适条件也能达到高效清除亚硝酸盐的效果。本实验拓展研究发现，强酸在强酸性环境下对亚硝酸盐有清除作用，如用盐酸使pH达到1.5，反应时间为15 min，其清除率达到8.3%，而pH为0.5时其清除率达到35.8%。