藤梨根提取物通过调控miR-451干预人食管鳞癌EC9706细胞的增殖

王涛 关徐涛 王冰 万姜维 邹善思 崔学梯 高萍

(河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)

食管恶性肿瘤的治疗手段多样，早期首选手术和放疗，然而由于受教育的程度不同及生活条件的限制，患者对食管恶性肿瘤认识不深刻，大多数患者就诊时已是中晚期，给临床医生增加了治疗难度，一定程度上影响治疗效果〔1〕。超过50%以上的中、晚期食管癌患者5年生存率相对较低，并且容易复发，转移率高。中医中药在防治恶性肿瘤中发挥重要作用。本课题以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象，观察藤梨根提取物(RAE)对食管鳞癌细胞EC9706增殖抑制情况。

1 材料与方法

1.1藤梨根的制备〔2〕将1 kg的藤梨根(来自河南中医药大学第一附属医院中药房)用机器加工粉碎，然后将粉碎好的藤梨根用烘干机去除水分以备实验。取烘干后的粗粉0.5 kg，另取2 L正丁醇溶液，将藤梨根粉加入溶液中泡制约1 d；反复回流3次，每次1 h，后进行提取、过滤；然后将3次的回流液合并在一起，真空干燥后将RPMI1640培养液加入其中；加热、旋转、溶解，制备成饱和的溶液；经过灭菌处理后可获取500 ml的原液(浓度1 g/ml，pH3.8)。将原液进行稀释，制备成不同的药物浓度，再次过滤、灭菌处理后分装，放入冰箱中以备使用(冰箱温度5℃)。

1.2食管鳞癌细胞株EC9706的培养 食管鳞癌细胞株EC9706购于郑州大学微生物教研室，放置在室温37℃，5%CO2的条件下培养生长，培养液为RPMI1640，每2 d传代1次，实验时取对数生长期的细胞。

1.3试剂与仪器 PCR仪，美国PE公司PE9600型；流式细胞仪，美国BECTONDickinson公司；比色仪，芬兰KHB公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；高速冷冻离心机，日本HITACHI、20PR-5型；隔水式恒温培养箱，上海精宏有限公司、GNP-9080型；稳压恒流电泳仪，北京市六一仪器厂DYY-8B型；紫外分光光度仪，日本HITACHI、U-2001；电泳槽，北京六一仪器厂。

1.4实验方法

1.4.1比色法测定RAE的细胞毒性〔3〕选取处于对数生长期的EC9706细胞，调整其浓度为2×105/ml。将RAE制备成1、5、10、100、1 000 μg/ml 5种不同的浓度。设96孔板，各孔加入100 μl细胞，加入RPMI1640培养液使总量达到200 μl。根据不同的浓度分别设立空白对照组，不同的浓度设3个平行孔，然后培养48 h(恒温36℃，5%CO2饱和湿度)，再加入噻唑蓝(MTT)(5 g/L)20 μl培养2 d后取出，放入平板离心机中离心，将上清液去除，在显微镜下观察MTT蓝色结晶数，加入150 μl二甲基亚砜使反应停止，在570 nm处用比色仪测定其吸光度(OD值)，反映存活细胞数目及其生物活性，计算RAE对细胞的抑制率。计算公式：抑制率=(对照孔OD值-用药孔OD值)/对照孔OD值。

1.4.2RT-PCR方法检测EC9706细胞株中miR-451表达水平〔4〕取对数生长期的EC9706细胞。将1 ml Trizol试剂加入25 ml的细胞培养瓶中，混合均匀，放入超净台内5 min，使细胞脱壁、黏液变稠。将液体转入到离心管中〔先用1.5 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)进行处理〕，加入氯仿0.2 ml，4℃、12 000 r/min离心15 min。取离心后的上层液体约5 μl，加入0.5 ml异丙醇，震荡使其均匀，放置室温约15 min。倒掉上清后加入75%灭菌异丙醇1 ml，将管壁上的RNA沉淀、飘起，然后进行洗涤，4℃、7 500 r/min离心10 min后，所得沉淀即是提取的总RNA。在空气中干燥10 min，加入20 μl DEPC水。-80℃的低温冰箱中保存备用。

首先逆转录生成cDNA，反应体系：4×dNTP 1 μl，miR-RT引物(序列：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTG-GCA3′)1 μl，5×RT缓冲液4 μl，M-MLV 0.5 μl，总RNA 1 μl，RNaseFreeH2O补足20 μl体积，反应程序：37℃ 60 min，85℃ 10 min。生成cDNA后再行PCR扩增，扩增体系：miR-451特异性引物1 μl(引物序列：前向：5′TCCGATTGAGTCATTACCAT3′，反向5′GTGCAGGGTCCGAGGT3′)，2×PCR缓冲液20 μl，Taq酶0.2 μl，miRNA逆转录产物cDNA 1 μl，ddH2O补足40 μl体积;反应程序：95℃ 3 min预变性；95℃ 15 s，65℃ 45 s，循环40次。全部反应均设置3个复孔，扩增仪为ABI7500Fast仪器。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件，采用线性回归计算IC50，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1RAE的细胞毒性作用 当RAE浓度≤10 μg/ml时，与空白对照组相比，细胞的抑制率差异无统计学意义(P>0.05)，RAE 100 μg/ml和1 000 μg/ml的抑制率与空白对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.05)，见表1。因此本实验选取RAE 10 μg/ml为合适的实验浓度。

2.2食管鳞癌细胞EC9706中miR-451表达水平的测定 食管鳞癌细胞株中miR-451相对表达量(4.14±1.06)明显低于空白对照组(11.68±3.86，P<0.01)。

表1 RAE的细胞毒性检测结果

与空白对照组比较：1)P<0.05

2.3各组miR-451表达水平比较 对照组为食管鳞癌细胞株EC9706+RPMI1640培养液，实验组为食管鳞癌细胞株EC9706+RAE，实验组的miR-451基因表达水平(7.98±0.85)与对照组(10.44±0.73)比较差异有统计学意义(t=6.919，P<0.05)。说明RAE可以上调食管鳞癌细胞miR-451基因的表达水平。RT-PCR电泳图见图1。

1：DNA marker;2、3：实验组；4：对照组图1 各组RT-PCR电泳图

3 讨 论

随着医学技术的进步，分子靶向药物在治疗各种恶性肿瘤方面起着越来越重要的作用。不同的细胞发生癌变的途径不同，分子靶向治疗就是阻断那些容易发生变性的不同环节，有的对细胞信号的传导通路产生阻断，有的则是针对抑癌或者原癌基因；不同的细胞因子及其受体、肿瘤新生血管形成这些也是靶向药物研究的对象。以分子水平为出发点，探索恶性肿瘤生物学行为，寻找新的治疗手段阻断其发展，进而达到控制恶性肿瘤细胞生长，甚至达到肿瘤细胞消失是一种新的治疗模式。

食管癌是多种基因和饮食、环境、工作压力等多因素相互作用形成的一种恶性消化道肿瘤，主要有两大病理类型：食管腺癌及食管鳞癌。根据流行病学研究结果，食管腺癌主要发生在西方发达国家〔5〕，而食管鳞癌主要发生在以我国为主的发展中国家，其中50%以上发生在河南林县、北部太行山区、苏北地区、川北地区、潮汕地区及新疆哈萨克族聚居地区等〔3〕。

传统医学对于癌症病毒病机的认识可概括为“劫掠精微，耗伤正气，阻滞气机，凶险难愈，传舍为患”，治疗上采用辨证论治，四诊合参，以整体观念为指导，基本治法为扶正抗癌解毒〔6〕。以祖国传统医学辨证论治用药为根基，优先考虑临床抗癌疗效明显的中药进行研究，寻找其中毒性较低、对化疗起到增敏作用的中草药，并研究其分子作用机制及基因水平作用靶点，对于推广和普及中医药在抗肿瘤方面的作用、提高不同肿瘤的综合治疗效果大有裨益。古书《开宝本草》中首次记载了藤梨根，称其为猕猴桃根，作用广泛，用于多种疾病的治疗，尤其在肿瘤方面用处较多〔4〕。藤梨根具有抑制恶性肿瘤生长、调节机体免疫的作用，可用于治疗各种消化道恶性肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌等〔7,8〕。临床实验研究〔9〕证实，在体外以藤梨根为基础的复方制剂通过多种不同途径发挥抗癌作用，能够减缓各种肿瘤的生长速度。本课题组前期研究可以表明，RAE可以调控食管鳞癌细胞中多种基因的mRNA表达。而近期的研究表明，多种基因表达的调控与非蛋白质编码miRNA-451的表达上调有关〔10〕。

miRNA并不是编码蛋白，然而它们但却在细胞的增殖、分化、凋亡和基因调控、免疫应答及肿瘤的发生、发展和预后的过程中发挥了重要作用。在肿瘤的发生及发展过程中，miRNA发挥两种作用。很多文献已报道，诸如在食管、胃、大肠及肝等恶性肿瘤组织〔11〕中miRNA表达失常。随着医学技术的进步，依靠基因芯片技术、原位杂交技术等寻找非蛋白miRNA在各种消化道恶性肿瘤细胞中的表达，并且分析这些miRNA引起肿瘤的机制及其引发肿瘤的靶点，可以为探索各种消化道肿瘤的发病机制及治疗手段开拓新的领域〔12〕。

本次实验结果证实，RAE有一定的细胞毒性，并且该提取物可以上调食管鳞癌细胞miR-451的表达水平。今后我课题组将从不同证型的动物实验出发，探讨藤梨根对不同证型食管癌模型的抑制作用。