2型猪链球菌细胞分裂蛋白GpsB的原核表达及其鉴定

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细菌细胞生长和分裂过程是息息相关的。众多蛋白质构成复杂的功能网，它们在时间和空间上相互作用，保证分裂过程有条不紊地进行，最终使一个母细胞形成两个相同的子细胞[1-3]。GpsB蛋白在细胞分裂过程中发挥着至关重要的作用，它可通过调控肽聚糖合成酶PBP1的活性来影响细胞壁的合成，并可与分裂体的中心组分FtsZ蛋白以及肽聚糖合成蛋白PBPs发生相互作用[4]。GpsB蛋白不仅与细胞分裂过程有关，还参与磷酸化调节。在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中，GpsB可被丝苏氨酸激酶磷酸化，说明GpsB 可能参与内部与外部细胞壁结构的转换[5]。另外在单细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)研究中发现，gpsB对细菌毒力具有重要作用，该基因的缺失导致细菌生长受阻以及对细胞自溶更加敏感[6]。

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的新发人兽共患病原体，根据S.suis荚膜多糖抗原的不同，可将其分为33个血清型，不同血清型之间的毒力不同，其中2型S.suis(S.suis2)致病性最强[7-8]。人感染该菌后可导致脑膜炎、心内膜炎以及败血症，严重者则因感染性休克而死亡[9-11]。据报道，S.suis2导致的中毒性休克综合征感染人的死亡率可达20%[12]。因此对S.suis2的致病机理研究显得至关重要。GpsB调控细胞分裂过程，且与细菌毒力有关，但在S.suis2中未见有关gpsB的研究报道，因此gpsB在S.suis2中的作用具有很高的研究价值。本实验利用原核表达载体表达纯化获得rGpsB并制备其多克隆抗体，为进一步研究GpsB在S.suis2中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株S.suis2菌株05ZYH33、表达载体pET32a由本实验室保存，大肠杆菌感受态E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)购于北京全式金公司。

1.2试剂 pEASY-T1 simple 克隆试剂盒和GelStain购于北京全式金公司；PCR产物回收和质粒提取试剂盒以及IPTG购于上海生工生物工程公司；限制性内切酶BamH I和XhoI、T4连接酶和DNA Marker 购于日本Takara ；DNA胶回收试剂盒购于美国Promega 公司；Ni离子亲和层析柱购于南京金斯瑞公司；羊抗鼠IgG(HRP标记)购于北京bioss公司。

1.3目的基因gpsB生物信息学分析 使用Blast检索出GpsB的同源蛋白序列，用ClustalX R软件分析上述氨基酸序列。

1.4gpsB基因的扩增 根据gpsB基因设计上下游引物，上游引物417F：5′-CGGGATCCATGGCAAGTATTAAATTTACG-3′ 下游引物417R：5′-CCCTCGAGTCATTCTTGATCCTGAACG-3′ (下划线标注的分别为BamH I和XhoI两个酶切位点。)引物由金维智公司合成。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 30 s， 54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s， 共30个循环；72 ℃ 10 min。目的片段经琼脂糖凝胶电泳分析并回收。

1.5表达载体的构建与鉴定 参照文献[13]略作修改。将目的片段与pEASY-T1 Simple Cloning Vector 连接，并转化至Trans-T1感受态细胞中，挑取单菌落送至苏州金维智公司测序。重组质粒与pET32a 载体经双酶切(所用酶为BamH I和XhoI)、割胶回收、T4 DNA连接酶连接并转化至感受态细胞E.coliDH5α，挑取单菌落送至苏州金维智公司测序。

1.6rGpsB的表达纯化及鉴定 将重组表达载体转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)。将阳性转化子接种于LB培养基中过夜培养，以1∶50的比例接种震荡培养至OD600=0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.1 mmol/L，震荡培养3～4 h。离心收菌后，超声破碎，离心10 min分离上清和沉淀，取适量上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，将上清和包涵体中的蛋白分别纯化，具体纯化方法参考文献[13]。采用两组不同的抗体对重组蛋白进行Western blot 鉴定：1)以His-Tag 单克隆抗体(1∶2 000)为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG 单克隆抗体(1∶5 000)为二抗；2)以GpsB鼠多克隆抗体(1∶2 000)为一抗，以HRP标记羊抗鼠IgG 单克隆抗体(1∶5 000)为二抗。

1.7GpsB鼠多抗血清制备及效价测定[11]取6周龄BALB/c小鼠进行免疫，首次免疫将重组蛋白(100 μg/只)与完全弗氏佐剂等体积乳化，皮下多点注射。再次免疫改用不完全弗氏佐剂，每隔2周免疫一次，共免疫3次。最后用未经乳化的重组蛋白加强免疫，3 d后眼球取血。

2 结 果

2.1GpsB生物信息学分析 Blast 结果显示，GpsB蛋白在S.suis菌株中高度保守，S.suis2菌株中的GpsB蛋白与S.azizii，S.marmotae，S.minor，S.ovis等不同细菌的GpsB同源性较高，相似性在83%～65%之间。

图1 GpsB同源蛋白多重序列比对分析Fig.1 Alignment of GpsB homologous proteins from several bacteria

2.2gpsB基因的扩增 设计引物并进行PCR，获得的产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示扩增得到的产物大小在250～500 bp之间(图2)，与预期目的基因大小(333 bp)一致，说明成功扩增出目的基因。

M: DNA marker, 1: gpsB PCR 产物

2.3重组质粒 pET32agpsB双酶切鉴定 PCR 产物经双酶切、琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，双酶切结果显示有两个条带，有一条带大小在250～500 bp之间，与预期目的基因大小(333 bp)一致。测序结果显示该片段序列与Genbank中SSU05_417序列一致，说明成功构建出重组表达载体。

M: DNA marker, 1: BamH I/XhoI双酶切 pET32agpsB

2.4rGpsB 的诱导及表达形式鉴定 重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)后经IPTG诱导后，所表达的蛋白大小在25～35 kD之间，与预期蛋白(30 kD)大小一致；菌体经超声破碎后进行SDS-PAGE电泳，结果显示4号泳道诱导E.coliBL21/pET32agpsB重组菌在30 kD处有一条较深的条带，说明GpsB蛋白被成功诱导出来，5号泳道显示诱导BL21/pET32agpsB上清在30 kD处也有一条较深的条带， 而6号泳道在对应位置无条带出现，说明目的蛋白存在于上清中。

M:蛋白分子质量标准,1:未诱导E.coli BL21/pET32a,2:诱导E.coli BL21/pET32a,3:未诱导E.coli BL21/pET32agpsB重组菌,4:诱导E.coli BL21/pET32agpsB重组菌,5:诱导E.coli BL21/pET32agpsB上清,6:诱导E.coli BL21/pET32agpsB沉淀。

2.5rGpsB的鉴定 蛋白经纯化浓缩后，进行Western-blot分析。rGpsB分别与His-Tag单克隆抗体、GpsB多克隆抗体反应均出现单一条带。(图5)

A:重组蛋白 Western-blot分析, M:蛋白分子质量标准, 1: rGpsB与His-Tag 单克隆抗体反应条带, B:重组蛋白Western-blot 分析, M:蛋白分子质量标准, 1: rGpsB与GpsB多克隆抗体反应条带。

2.6GpsB鼠多抗血清效价 BALB/c小鼠经免疫得到GpsB鼠多抗血清，ELISA测定抗体效价为1∶102 400。

3 讨 论

GpsB的晶体结构研究发现，GpsB通常由100个氨基酸组成，含有两个结构域，65-70个氨基酸组成N端结构域，是蛋白的脂质结合域[13]，20-25个氨基酸组成C端结构域。N端结构域和C端结构域分别组装成二聚体和三聚体，但全长GpsB蛋白是六聚体[14]。从结构和功能等各方面来看，GpsB和另一种分裂蛋白DivIVA都存在相似性，并且两个蛋白可发生相互作用。在前期课题组的研究中发现，DivIVA属于S.suis2的一种毒力因子，与细菌生长分裂有关。DivIVA基因缺失时，细菌无明显的链状结构，多数菌体聚集成团，生长受到严重阻碍，突变株基本无致病性[15]。作为DivIVA的同源蛋白，GpsB在S.suis2中是否也发挥同样的作用仍有待考证。

GpsB在革兰阳性菌细胞壁的合成中发挥着重要作用。在李斯特菌中，敲除株细胞壁的功能性变弱，对β-内酰胺的耐受性减弱，细胞更易自溶[16-17]。而在肺炎链球菌中，gpsB突变体在细胞分裂隔膜的闭合中存在缺陷，因此细胞呈长条状，Z 环呈不规则形状[16,18]；GpsB 通过抑制PBP2x 来调节外周肽聚糖(peptidoglycan，PG)的合成，这对隔膜的闭合起着至关重要的作用。另外在枯草芽孢杆菌中，gpsB、ezrA双敲除株细胞伸长，并且容易发生自溶[19]，这极有可能是gpsB的突变导致肽聚糖合成的机器—PBP1定位错误，从而不能正确合成肽聚糖，影响了细胞壁的合成。GpsB不仅与细胞壁合成有关，并参与磷酸化调节[20]。在枯草芽孢杆菌中研究发现，GpsB能被真核样丝/苏氨酸激酶(Serine/threonine kinase，STK)磷酸化，STK同时也受到GpsB磷酸化的负反馈调节[5]。在肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)中发现，GpsB通过磷酸化分裂蛋白DivIVA，来减弱其在细胞伸长方面的作用[21]。GpsB蛋白的第75位的苏氨酸可被PrkC磷酸化，但并不调节细胞分裂过程，而是PrkC功能所需，可能是负反馈调节的一部分[22]。由此可见，GpsB蛋白是一个多功能蛋白，在各菌中发挥的作用也不尽相同。但关于该蛋白在猪链球中的作用未见相关报道，因此该蛋白在猪链球中的作用具有研究意义。

本实验首先根据目的基因序列设计引物，PCR扩增后获得目的基因克隆，并将其连接到pET32a表达载体上，成功构建出重组表达载体。利用IPTG诱导的方式，在原核表达系统中获得目的蛋白。目的蛋白超声破碎后经SDS-PAGE鉴定发现，蛋白主要存在于上清中且条带颜色较深，说明蛋白活性较高且表达量较多。利用Ni离子亲和层析柱纯化上清中的蛋白，经浓缩后蛋白纯度较高。分别以His-Tag 单克隆抗体和GpsB蛋白多克隆抗体为一抗进行Western blot 鉴定，结果显示反应均出现单一条带，无杂带，结果表明实验成功制备出rGpsB，且纯度较高。利用重组蛋白制备的多抗血清经ELISA测定效价为1∶102 400，制备的多抗血清可用于后续实验。本研究结果为进一步研究gpsB在S.suis2中的作用奠定了基础。