秀水134为背景的染色体片段代换系的构建

孟卓玲 曹玉洁 单丹丹 方春 缪小菲 费月新方柄杰 王越 赵文佳 侯璐燕 吴敏 吴洪恺

（浙江农林大学 农业与食品科学学院，杭州311300；#共同第一作者；*通讯作者：hongkaiwu＠163．com）

水稻是我国的主要粮食作物，世界上一半以上的人口以稻米为主食。水稻也是主要粮食作物中基因组较小的作物。随着分子生物学和基因组学的发展，水稻作为模式生物，一方面，大规模创造突变体库；另一方面，构建遗传分析群体，开展了广泛的分子生物学和基因组学研究。

性状遗传分析的基本方法是，一对相对性状杂交构建分离群体，根据目标性状在分离群体中的表现，推断目标性状的遗传特征。随着分子生物学和基因组学的发展，重要农艺性状基因或QTL（Quantitative Trait Locus）的定位和克隆成为遗传学研究的重要内容，遗传分析群体同时又作为基因定位群体。最常用的群体有F2群体和回交F1群体，这类群体构建简单，工作量小，时间短，但目标性状检测只能以单株（个体）进行，每种基因型仅由1个单株（个体）提供表型值，对于受环境影响较大的性状，如产量，性状值度量可靠性差。F2∶3群体，即用F2群体中1个个体衍生的F3群体（一般10～30个个体）的平均值代表1个F2个体的表型值，可以减小性状值度量的误差[1]。但与F2群体和回交F1群体一样，个体中有杂合基因型，不能设置重复来估计或减小误差。重组自交系群体（Recombination Inbred Lines,RIL）和加倍单倍体群体（Double Haploids,DH），这类群体的各个株系的基因型都是纯合的，可以多年多点种植，通过设置重复来减小或估计误差，提高了目标性状鉴定的准确性。但这类群体的遗传背景复杂，个体间遗传差异大，对复杂的遗传性状来说，“遗传噪音”大，基因定位的准确性低。

Paterson等[2－3]提出了构建染色体片段代换系（Chromosome segment substitution lines,CSSLs）用于基因精细定位和图位克隆研究。CSSLs每个系与受体亲本的遗传差异仅限于某一染色体的代换片段，它们的表型差异只是由该代换片段的差异所引起，能有效地消除遗传背景的干扰。CSSLs可以提高复杂农艺性状基因定位的精确性，尤其是遗传效应较小的数量性状基因。在初步定位的基础上，含有目标QTL的染色体片段代换系与受体亲本杂交，建立次级分离群体，使QTL定位分析锚定在很窄的染色体片段上，进一步消除遗传背景的干扰，从遗传上和统计上提高了QTL定位和效应估计的准确性。日本水稻基因组研究计划Yano研究组构建了以Nipponbare为遗传背景的Kasalath全基因组染色体片段代换系，并将水稻抽穗期QTLHd-1、Hd-2、Hd-6和Hd-8分别分解为单个孟德尔因子，将Hd-3分解为2个单基因Hd-3a和Hd-3b，且精细定位了Hd-1、Hd-2、Hd-3a、Hd-3b、Hd-6和Hd-8等 6 个基因[4－5]；在此基础上，图位克隆了Hd-1、Hd-3a和Hd-6[6－8]。日本九州大学Yoshimura研究组构建了分别以Asominori和IR24互为遗传背景的两套全基因组CSSLs[9－10]和一套以Taichung65为遗传背景的非洲稻全基因组CSSLs[3]。Doi等[11]利用该CSSLs将第10染色体上抽穗期主效QTL分解为单基因Ehd1，并成功进行了图位克隆。

图1 秀水134和扬稻6号间多态性分子标记连锁图谱

以上这些研究成果和染色体片段代换系在有利基因发掘方面的优越性，极大地鼓舞了国内研究者开展构建染色体片段代换系的构建工作[12-13]。

1 材料与方法

1.1 材料

秀水134，浙江省推广面积最大的晚粳稻品种，作为背景亲本；扬稻6号，超级稻亲本，为供体亲本。

1.2 方法

1.2.1 多态性分子标记的筛选和连锁图谱的构建

根据McCouch构建的分子标记连锁图谱[14]，选择分子标记进行秀水134和扬稻6号间多态性分析；用Mapchart 2.2绘制多态性SSR标记连锁图。

1.2.2 染色体片段代换系构建

分3步进行：

第1步，亲本秀水134和扬稻6号杂交并自交获得F2群体；从F2群体中随机选择单株与秀水134回交，获得BC1F1群体；BC1F1群体中随机选单株与秀水134回交，获得BC2F1群体；对BC2F1群体进行分子标记基因型鉴定，根据分子标记基因型，选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的单株，初步构建覆盖全基因组的代换系（杂合型）。

图2 以秀水134为轮回亲本和扬稻6号构建染色体片段代换系（杂合型）

第2步，每个代换系继续与秀水134回交，得到BC3F1群体，进行分子标记基因型鉴定，根据分子标记基因型，选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的单株，构建覆盖全基因组的代换系（杂合型）。

第3步，BC3F1群体自交，在后代群体中进行分子标记基因型鉴定。选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的纯合单株，组成覆盖全基因组的代换系（纯合型）。

1.2.3 代换片段长度的计算

按Young等[15]的方法计算代换片段的长度，不考虑2个相邻分子标记间发生双交换事件。当相邻标记的基因型和供体亲本的基因型相同时，认为这2个分子标记覆盖的染色体区段为供体的代换片段；当相邻标记基因型分别和供体亲本、受体亲本相同时，认为这2个标记之间的中点为该代换片段的边界点，两端边界点之间的距离就是该代换片段的长度。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记连锁图谱的构建

根据McCouch等[14]构建的分子标记连锁图谱，从中选择了629对引物，进行秀水134和扬稻6号间多态性分析，筛选到两个亲本间有多态的引物263对，亲本间多态性比例为41.8%。选择PCR扩增条带分辨清晰，且均匀覆盖水稻12条染色体的95对多态性分子标记，用Mapchart2.2绘制多态性SSR标记连锁图（图1），全基因组总长度为1 499.6 cM。

2.2 染色体片段代换系的构建

分3步进行：

第1步，亲本秀水134和扬稻6号杂交并自交获得F2群体；从F2群体中随机选择97个单株与秀水134回交，获得BC1F1群体，共97个株系；BC1F1群体每个株系种植10株，随机选1株与秀水134回交，获得BC2F1群体，共97个株系；BC2F1群体中每个株系随机选3株进行分子标记基因型鉴定，根据分子标记基因型，选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的单株，筛选了53株（另24个单株作为备份），初步构建覆盖全基因组的代换系（杂合型），见图2。

第2步，每个代换系继续与秀水134回交，得到BC3F1群体，共53个系，1 350株。对1 350株进行分子标记基因型鉴定，根据分子标记基因型，选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的单株，筛选了198株，构建覆盖全基因组的代换系（杂合型），原理同第一步，图略。

1代表扬稻6号基因型，2代表杂合型，3代表秀水134基因型。

图4 图示染色体代换系构建流程

第3步，198株（杂合型）自交，得198个株系，每个株系种植21～24株，共取样4 086株，进行分子标记基因型鉴定。选择代换片段尽量少、目的片段尽量长的纯合单株，组成覆盖全基因组的代换系（纯合型），见图3。

以上3步的具体流程图示为图4。

2.3 染色体片段代换系的构建质量评价

对染色体片段代换系的53个株系的代换片段长度进行分析，代换片段最大的为7X5号株系，为182．15cM，占全基因组的 12．15%；代换片段最短的为7X29 号株系，为 7．4cM，占全基因组的 0．49%，见图 5。该套染色体片段代换系代换片段总长度平均值75．30cM，占全基因组 5．00%。

12条染色体代换片段覆盖总长度为1 995 cM，覆盖水稻全基因组的1．33倍（表1）。其中，4号染色体的代换片段覆盖总长度最长，为212．7cM，覆盖4号染色体基因组的1．66倍；12号染色体代换片段覆盖长度最短，为76．6 cM，覆盖12号染色体基因组的0．77倍。除7号、10号、11号、12号染色体的代换片段没有完全覆盖各自的染色体基因组外，其余都覆盖了整条染色体基因组。

图5 染色体片段代换系的代换片段长度的变异

表1 染色体片段代换系各染色体目的代换片段长度

3 讨论

3.1 染色体片段代换系构建的策略

染色体片段代换系作为发掘和鉴定有利基因的有力工具得到了广泛的应用[16]。染色体片段代换系（chromosomal segment substitution lines,CSSL），又称为染色体片段导入系（chromosomal segment introgression lines,CSIL）。基本的构建过程是：供体与受体杂交获得F1；受体作为轮回亲本，回交获得BCnF1；自交，获得目的位点基因型纯合的个体，借助分子标记选择，筛选来自供体的一个或多个代换片段的单株；所选单株的代换片段互相重叠，覆盖全基因组，组成染色体片段代换系。可以采取两种主要的策略：（1）BC1F1进行分子标记选择，一开始就选定目的代换片段，组成完整的一套片段代换系，覆盖整个基因组。不断回交，在以后的世代中，一直选择目的代换片段，同时进行背景选择，直到获得只有目的代换片段或带少数几个非目的代换片段的单株，所有这些单株的目的代换片段互相重叠，覆盖全基因组，这样就获得了一套完整的染色体片段代换系。这样的策略，获得的代换片段长，但回交工作量大，耗时长。这是日本前期构建染色体片段代换系的策略。（2）在BC1F1群体中随机选择48株回交，得到48个株系，每个株系中随机选择1株回交，得到48个BC3F1株系，每个株系随机选1株自交，得到48个BC3F2株系，每个株系选200～300株，进行分子标记基因型鉴定，筛选目的代换片段，下同方法1。这种方法，回交工作量小，耗时短，但分子标记鉴定工作量大。在染色体片段代换系构建过程中，可以把这两种方法结合起来，做到取长补短。

3.2 染色体片段代换系的应用

以染色体片段代换系为材料可以提高对复杂农艺性状基因定位的精确性，尤其适用于遗传效应较小的数量性状基因定位与克隆。在初步定位的基础上，含有目标QTL的代换系与受体亲本杂交，建立次级分离群体，使QTL定位分析锚定在很窄的染色体片段上，进一步消除遗传背景的干扰，从遗传上和统计上保证了QTL的精确定位。在明确控制重要性状基因的基础上，大力发掘和评价其等位性变异，可以开展设计育种[17]。这一过程中，利用已经鉴定出的各种重要育种性状QTL的信息，包括QTL在染色体上的位置、遗传效应、QTL之间的互作、QTL与背景亲本和环境之间的互作等，模拟预测各种可能基因型的表现型，从中选择符合特定育种目标的基因型，大幅度提高育种效率[18]。

本研究得到中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才研究员的大力支持，谨致谢意!