中国南海软珊瑚真菌Eupenicillium sp. DX-SER3 (KC871024)的次级代谢产物研究

2019-04-11谭雁鸿李基兴林秀萍杨斌刘永宏李云秋

热带海洋学报 2019年2期

谭雁鸿, 李基兴, 林秀萍, 杨斌, 刘永宏, 李云秋

中国南海软珊瑚真菌sp. DX-SER3 (KC871024)的次级代谢产物研究

谭雁鸿1, 2, 李基兴1, 2, 林秀萍2, 杨斌2, 刘永宏2, 李云秋1

1. 桂林医学院药学院, 广西桂林 541004; 2. 中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东广州 510301

文章旨在对中国南海软珊瑚来源真菌sp. DX-SER3 (KC871024)进行次级代谢产物的研究。利用硅胶层析柱、正反相中压层析柱以及半制备高效液相等方法对该菌株的大米发酵产物进行分离纯化, 利用核磁共振、质谱等波谱学方法并参考文献数据对分离的单体化合物进行结构鉴定。从中分离得到5个已知化合物: 烟曲霉酸、-腺苷、2'-脱氧胸腺嘧啶核苷、-acyltryptamine和对羟基苯甲醛。其中, 烟曲霉酸在该菌株中产量很高, 预示着该菌株具有开发成该类化合物的工程菌株的潜力。文章还探讨了烟曲霉酸抗植物病原真菌的潜力, 发现效果并不明显。

中国南海; 软珊瑚;sp.; 次级代谢产物

广阔的海洋孕育着极其丰富的生物资源, 作为一种常见的海洋无脊椎动物, 软珊瑚及其共附生微生物已经成为海洋天然产物研究的重要对象(邢倩, 2014)。随着微生物采集技术、化合物分离纯化及波谱解析技术的进步, 越来越多的海洋天然产物的化学结构得以被发现并解析, 并且成为药物先导化合物的重要来源(Li et al, 2015),具有良好的生物活性, 如抗菌、抗肿瘤、抗污等(田永奇等, 2017)。青霉属()是海洋真菌的第二大种类, 属于子囊菌亚门, 不整囊菌纲, 散囊菌目, 散囊菌科, 也是海洋天然产物的重要源泉。正青霉属(sp.)是青霉属真菌的一个重要分支, 目前国内外对从软珊瑚来源的正青霉属真菌还未有深入研究, 其次级代谢产物研究也报道较少。

Zheng等(2018)从红树林来源真菌sp. HJ002中分离得到3个新型吲哚二萜类化合物penicilindoles A~C, 其中penicilindole A 对A549与HepG2肿瘤细胞具抑制活性, 50%抑菌浓度(IC50)值分别为5.5μM和1.5μM; Gu等(2018)从海绵来源真菌sp. 6A-9中分离得到比较罕见的萜类成分eupeniacetal A、eupeniacetal B、1-oxymethyl- hydropreaustinoid A1、hydroberkeleyone B和22-deoxy-10-ketominiolutelide B, 这些化合物均显示出对TNF-产物诱导THP-1细胞系凋亡的抑制活性, 但对正常肿瘤细胞系无明显活性; Li等(2017)从植物内生真菌分出的sp. LG41中分离得到十氢化萘类结构eupenicinicols C和D, eupenicinicols D显示出抗金黄色葡萄球菌活性。本文报道了从中国南海软珊瑚来源真菌sp.的大米发酵产物中分离的5个化合物(图1)。

图1 分离得到5个化合物的化学结构

1. 烟曲霉酸; 2.-腺苷; 3. 2'-脱氧胸腺嘧啶核苷; 4.-acyltryptamine; 5. 对羟基苯甲醛

Fig. 1 The chemical structures of compounds 1-5

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器包括旋转蒸发仪(EYELAN-1100V-W型,日本东京理化株式会社)、AV-500和AV-700核磁共振仪(德国Brucker公司)、HITACHI L-2400半制备HPLC(日本日立公司)、ZYJ-S型超净工作台(苏州净化设备有限公司)、中压制备柱色谱仪(Buchi公司产品C615/605)、HR-ESM-MS (德国Brucker公司)。主要试剂包括薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂)、10~40和100~200正相硅胶(烟台江友硅胶开发有限公司)、反相硅胶(Merck公司)及分析纯级化学试剂(广州化学试剂厂和天津市富宇精细化工有限公司)等。

1.2 菌株发酵培养

供试软珊瑚附生菌株sp. DX- SER3 (KC871024)保存于4℃环境。该菌株接种到PDA琼脂固体斜面培养基上, 置于28℃培养箱培养7d。用接种针挑取适量孢子, 接种到含15mL MB培养液(麦芽粉15g, 海盐2.5g, 蒸馏水1000mL, PH 7.4~7.8)的150mL三角烧瓶中, 在25℃, 180r×min-1摇床条件下培养3d。将培养好的种子液分别接种到40瓶灭菌后的大米培养基(大米200g, 海盐2.5g, 蒸馏水250mL)中静置培养60d。

1.3 提取分离纯化

发酵完毕后菌株用两倍体积丙酮浸泡2d, 然后将大米捣碎, 超声20min, 用纱布进行过滤, 滤液减压浓缩以除去丙酮, 然后再用两倍体积乙酸乙酯萃取3次, 浓缩后得到乙酸乙酯粗浸膏, 滤渣继续用乙酸乙酯提取3遍, 浓缩后合并以上乙酸乙酯部分得总粗浸膏。粗浸膏采用中压色谱进行分离, 用100~200目硅胶拌样, 流动相为石油醚 : 乙酸乙酯(V : V 100 : 0 ~ 1 : 1, 流速50mL×min-1)梯度洗脱得到第一部分, 为42.5L, 再用石油醚 : 乙酸乙酯 :甲醇(V : V : V 20 : 20 : 1 ~ 0 : 0: 100, 流速50mL×min-1)梯度洗脱得到第二部分, 为17.5L。两部分通过薄层色谱法(TLC)检识合并得18个馏分。其中Fraction (5、7、9、11、15)经反相中压色谱(ODS)(MeOH : H2O 20 : 80 ~ 100 : 0)梯度洗脱, Frc.5分得13个子馏分, 其中Frc.5-2用半制备液相(MeOH : H2O 25 : 75)分离得到化合物5 (2.4mg), Frc.5-13用半制备液相色谱分离(MeOH : H2O 92 : 8)得到化合物2 (12.7mg); Frc.7经反复结晶得到化合物1 (1200mg); Frc.11分得15个子馏分, 其中Frc.11-7用半制备液相(MeOH : H2O 30 : 70)分离得到化合物4 (3.5mg); Frc.15分得8个子馏分, 其中Frc.15-7经半制备液相(MeOH : H2O 5 : 95)分离得到化合物3 (6.4mg)。

2 结果

2.1 化合物1的结构鉴定

白色结晶;1H-NMR (500MHz, CDCl3): 7.32 (1H, d,= 10.0Hz, H-1), 5.90 (1H, d,= 9.5Hz, H-16), 5.88 (1H, d,= 10Hz, H-2), 5.11 (1H, t,= 7.0Hz, H-24), 3.49 (1H, brs, H-6), 2.77 (1H, q,= 7.0Hz, H-4), 2.63 (1H, dd,= 13.0, 3.0Hz, H-9), 2.57 (1H, m, H-13), 2.44 (2H, m, H-22), 2.26 (1H, d,= 12.0Hz, H-5), 2.23 (2H, d,= 8.5Hz, H-15), 2.11 (3H, s, H-2'), 2.10 (2H, m, H-23), 1.96 (3H, s, H-2''), 1.93 (2H, d,= 14.5Hz, H-15), 1.83 (2H, dd,= 12.5, 3.5Hz, H-12), 1.69 (3H, s, H-27), 1.61 (3H, s, H-26), 1.57 (2H, m, H-11), 1.45 (3H, s, H-19), 1.28 (3H, d,= 7Hz, H-28), 1.18 (3H, s, H-29), 0.93(3H, s, H-18);13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 208.8 (C, C-7), 201.3 (C, C-3), 174.1 (C, C-21), 170.3 (C, C-1''), 168.9 (C, C-1'), 157.2 (CH, C-1), 147.4 (C, C-17), 132.9 (C, C-25), 130.5 (C, C-20), 127.9 (CH, C-2), 122.8 (CH, C-24), 73.8 (CH, C-6), 73.5 (CH, C-16), 52.7 (C, C-8), 49.4 (CH, C-13), 47.2 (CH, C-5), 46.6 (C, C-14), 41.7 (C, C-9), 40.7 (CH2, C-15), 40.4 (CH, C-4), 38.2 (C, C-10), 28.6 (CH2, C-22), 28.3 (CH2, C-23), 27.5 (CH3, C-19), 25.9 (CH2, C-12), 25.7 (CH3, C-27), 23.9 (CH2, C-11), 20.7 (CH3, C-2'), 20.5 (CH3, C-2''), 18.3 (CH3, C-29), 17.9 (CH3, C-18), 17.8 (CH3, C-26), 13.1 (CH3, C-28)。以上数据与文献(Fujimoto et al, 1996)对照一致, 故确定化合物1为烟曲霉酸。

2.2 化合物2的结构鉴定

黄色固体;1H-NMR (500MHz, DMSO-6): 3.54 (2H, s, NH2), 3.64 (2H, m, H-5'), 3.94 (1H, q,= 3.5Hz, H-4'), 4.13 (1H, m, H-3'), 4.56 (1H, t,= 5.0Hz, H-2'), 5.19 (1H, brs, OH-3'), 5.42 (1H, m, OH-2'), 5.45 (1H, m, OH-5'), 5.87 (1H, d,= 6.5Hz, H-1'), 8.12 (1H, s, H-2), 8.33 (1H, s, H-8);13C-NMR (DMSO-6, 125MHz): 61.9 (CH2, C-5'), 70.8 (CH, C-3'), 73.6 (CH, C-2'), 86.1 (CH, C-4'), 88.1 (CH, C-1'), 119.5 (C, C-5), 140.1 (CH, C-8), 149.2 (C, C-4), 152.6 (CH, C-2), 156.3 (C, C-6)。以上数据与文献(Domondon et al, 2004)一致, 故确定化合物2为-腺苷。

2.3 化合物3的结构鉴定

褐色固体;1H-NMR (500MHz, DMSO-6): 1.74 (3H, s, CH3), 2.03 (1H, m, H-2'a), 2.06 (1H, m, H-2'b), 3.33 (2H, brs, H-5'), 3.58 (1H, ddd,= 3.5, 4, 12Hz, H-4'), 4.22 (1H, m, H-3'), 5.07 (1H, m, 5'-OH), 5.27 (1H, m, 3'-OH), 6.16 (1H, dd,= 6.5, 7.5Hz, H-1'), 7.64 (1H, s, H-6), 11.21 (1H, s, NH);13C-NMR (DMSO-6, 125MHz): 12.4 (CH3, C-7), 39.4 (CH2, C-2'), 61.3 (CH2, C-5'), 70.4 (CH, C-3'), 83.8 (CH, C-1'), 87.2 (CH, C-4'), 109.3 (C, C-5), 136.0 (CH, C-6), 151.1 (C, C-4), 164.7 (C, C-2)。以上数据与文献(刘培培等, 2008)一致, 故确认该化合物为2'-脱氧胸腺嘧啶核苷。

2.4 化合物4的结构鉴定

褐色粉末;1H-NMR (700MHz, DMSO-6): 1.80 (3H, s, CH3), 2.81 (2H, t,= 7.7Hz, H-10), 3.32 (2H, dd, H-11), 6.98 (1H, t,= 7.7Hz, H-5), 7.07 (1H, t,= 7.0Hz, H-6), 7.14 (1H, d, H-2), 7.34 (1H, d,= 7.7Hz, H-4), 7.52 (1H, d,= 7.7Hz, H-7), 7.95 (1H, t, NH-12), 10.82 (1H, s, NH-1);13C-NMR (DMSO-6, 175MHz): 22.3 (CH3, C-14), 24.9 (CH2, C-10), 39.7 (CH2, C-11), 111.0 (CH, C-3), 111.5 (C, C-7), 117.8 (CH, C-4), 120.5 (CH, C-5), 122.2 (CH, C-6), 126.9 (C, C-9), 135.9 (C, C-8), 168.7 (C, C-13)。以上数据与文献(Oleinikova et al, 2006)一致, 故确认该结构为-Acyltryptamine。

2.5 化合物5的结构鉴定

淡黄色固体;1H-NMR (500MHz, CD3OD): 6.95 (2H, d,= 10Hz, H-2和H-6), 7.81 (2H, d,= 10Hz, H-3和H-5), 9.79 (1H, s, H-7)。以上数据与文献(赵爱华等, 2004)一致, 故确定为对羟基苯甲醛。

3 讨论

本课题组从南海软珊瑚真菌sp.大米发酵产物中分离鉴定了5个化合物, 包含1个抗生素(烟曲霉酸)、1个吲哚生物碱(–acyltryptamine)、2个核苷酸和1个含苯衍生物。菌株sp. SCSIO41205是从三沙市七连屿附近海域采集的短指软珊瑚中分离的一株真菌, 通过HPLC分析和代谢产物的分离, 发现该菌的大米固体发酵液中代谢产物十分单一, 主要产物为烟曲霉酸, 含量很高, 从8kg大米固体发酵液中得到1.2g。Chain等(1943)从100L烟曲霉菌的液体培养基中分得烟曲霉酸0.4g; Ratnaweera等(2014)从2.25L炭角菌的PDA液体培养基中分得烟曲霉酸3mg; Sanmanoch等(2016)从10L新萨托菌属的MB液体培养基中分得烟曲霉酸0.2g。本文研究真菌正青霉属分得烟曲霉酸含量远远高于其他菌属, 且易于分离, 因此该菌株可以作为生产烟曲霉酸的工业菌株。烟曲霉酸因具有良好的抗菌活性和显著的抗肿瘤活性而受到广泛关注。据报道, 烟曲霉酸于1942年首次从烟曲霉菌代谢产物中分离得到并命名(Chain et al, 1943)。Xiao等(2017)从冬虫夏草分离到的烟曲霉酸对不同人体癌细胞(胰腺、子宫、肝脏、肺)显示出有效抑制活性, 并且10mg×kg-1剂量烟曲霉酸结合20mg×kg-1环磷酰胺在体外展现较强抗癌活性的协同作用, 其肿瘤生长抑制率达到70.90%。Luo等(2017)从深海曲霉真菌sp. SCSIO Ind09F01中分离得到的烟曲霉酸具有抗痨作用, 并对结核杆菌有非常强的抑制活性, 50%最低抑菌浓度(MIC50)值小于0.894μM。作为一种抑菌剂, Sanmanoch等(2016)从新萨托土壤真菌KKU-1NK1乙酸乙酯提取部位分离得到的烟曲霉酸测试了对革兰氏阳性菌与阴性菌的抑制活性, 结果对革兰氏阳性致病菌株包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DMST 20654、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、腐生葡萄球菌ATCC 15305、肺炎链球菌DMST 15319、粪肠球菌ATCC 29212、枯草芽孢杆菌ATCC 6633和阴性致病菌株包括青枯雷尔氏菌、野油菜黄单胞菌都具有抑制活性, 其最小抑菌浓度(MIC)值都在16~32μg×mL-1范围内。Ratnaweera等(2014)通过色谱层析法从植物内生真菌炭角菌中分离得到的烟曲霉酸对革兰氏阳性菌枯草杆菌与抗药性金黄色葡萄球菌具有抑制活性, 其MIC值分别为2μg×mL-1与4μg×mL-1。此外有文献报道该化合物对胆固醇的累积有一定抑制作用(Shinohara et al, 1993)。为了探讨该化合物在农用抗菌的应用潜力, 我们通过纸片法测试该化合物对5种植物致病菌(水稻稻瘟菌Cav、芒果炭疽菌.T0408、橡胶炭疽菌RC178、香蕉枯萎杆菌. sp.race 4、薯蓣炭疽菌Cg9)的抑制活性, 结果该化合物并不显示抑制活性。

正青霉菌来源较为广泛, 从植物来源包含植物外皮组织、植物根茎与种子, 动物来源, 土壤来源以及其他来源如其他真菌代谢与衍生物等都可获得。其中以土壤来源和植物组织中来源正青霉属种类最多(季波等, 2017)。本文研究软珊瑚来源正青霉属真菌除烟曲霉酸外, 包含的两个核苷酸和一个含苯衍生物在自然界中都较为常见, 以及一个吲哚生物碱-acyltryptamine。Oleinikova等(2006)中发现-acyltryptamine具有微弱抗Erlich肿瘤细胞活性和溶血活性, 而在破坏深海海胆卵细胞膜与精子细胞膜实验中没有展现出活性, MIC大于50μg×mL-1。

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Study on the secondary metabolites from the South China Sea soft coral-derived fungussp. DX-SER3 (KC871024)

TAN Yanhong1, 2, LI Jixing1, 2, LIN Xiuping2, YANG Bin2, LIU Yonghong2, LI Yunqiu1

1. College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541004, China; 2. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China

We aim to study the secondary metabolites from the South China Sea soft coral-derived fungussp. DX-SER3 (KC871024). The rice fermentation products of the strain were purified by comprehensive chromatography methods of silica gel column, medium pressure preparative liquid chromatography (MPLC), ostade-cylsilane (ODS), and semi- preparative HPLC. The compounds’ structures were identified by nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectroscopy, and comparison with the reported data. Five known compounds were obtained and identified as helvolic acid,-adenosine, 2'-deoxythymidine,-acyltryptamine, and-hydroxybenzaldehyde. The high yield of the helvolic acid indicates that this strain has the potential to develop an engineered strain of this kind of compound. Helvolic acid was also tested for the activities of phytopathogenic fungus, and the result was not clear.

South China Sea; soft coral;sp.; secondary metabolites

2018-07-20;

2018-09-02. Editor: YIN Bo

National Natural Science Foundation of China (81741158, 20062115); Guangzhou Science and Technology Plan Project (201804010462)

P735.4

1009-5470(2019)02-0043-05

10.11978/2018072

2018-07-20;

2018-09-02。殷波编辑

国家自然科学基金项目(81741158、20062115); 广州市科技计划项目(201804010462)

谭雁鸿(1994—), 男, 江西省赣州市人, 硕士, 从事天然药物化学研究。E-mail: awdrg01234@163.com

刘永宏, E-mail: yonghongliu@scsio.ac.cn; 李云秋, E-mail: leeyq88@126.com