茯苓酸对小鼠病毒性心肌炎Caspase-3及Akt表达的相关研究；

陈伟光　张学峰　官莹　王柏春

【摘要】目的觀察茯苓酸在BALB/c鼠病毒性心肌炎动物模型中的疗效以及对Caspase-3和Akt表达水平的影响。方法选择BALB/c小鼠150只，随机分为正常对照组、模型对照组、茯苓酸组共三组，每组50只。制备小鼠病毒.性心，肌炎模型后茯苓酸组腹腔注射茯苓酸提取液0.1mLg，正常对照组及模型对照组分别给予腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.1mL/g，每日1次，连用15d。在第4、8、15d取出心脏，并进行病理学检查、Caspase-3及Akt蛋白表达检测。结果模型对照组小鼠心肌病理积分、心肌组织Caspase-3蛋白活性较正常对照组显著升高，与模型对照组相比，茯苓酸组心肌病理积分显著降低（P<0.05）;茯苓酸组Caspase-3表达活性相对较低，但与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）;模型对照组Akt蛋白表达较正常对照组显著降低（P<0.05），茯苓酸组Akt蛋白表达显著高于模型组（P<0.05）。结论茯苓酸可能是通过上调Akt蛋白的表达，激活PI3-K/Akt信号传导通路来改善病毒性心肌炎小鼠的心肌炎性和损伤。

【关键词】茯苓酸;病毒性心肌炎;科萨奇病毒B3;Caspase-3;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

中图分类号：R542.2

文献识别码：A

文章编号：1009-816X（2019）06-050 1-04

doi：10.3969/j.issn.1009.-816x.2019.06.004

The Related Research of Pachymic Acid on the Expression of Caspase-3 and Akt in Mice with Viral Myocarditis. CHEN Wei-guang，ZHANG Xue-feng，GUAN Ying ，Wang Baichun. Department of Cardiovascular Surgery，The First Affiliated Hospital ofHarbin Medical Uniwersity，Harbin 150001，China

[ Abstract] Objective To observe the effect of pachymic acid on the expression of Caspase-3 and Akt in BALB/c mice with viral myocarditis. Methods 150 BALB/c mice were randomly divided into three groups： normal control group， model control group andpachymaric acid group， 50 mice in each group. After the mice model of viral myocarditis was made， the pachymaric acid group wasintraperitoneally injected with porialic acid extract 0.1mL/ g， normal control group and model control group were given normal salineintraperitoneal injection of 0.1mL/g once a day continuously for 15 days. On the 4th， 8th and 15th day， the heart was taken forpathological test and the detection of Caspase-3 activity and Akt protein expression. Results The myocardial pathological score and the activity of Caspase-3 protein in the model control group were significantly higher than those in the normal control group. Comparedwith the model control group， the myocardial pathological score in the pachymic acid group was significantly lower（ P<0.05）， theexpression activity of Caspase-3 in pachymic acid group was relatively low， but there was no significant difference between pachymicacid group and model group（ P > 0.05 ）. The expression of Akt protein in the model control group was significantly lower than that inthe normal control group（ P <0.05 ）， the expression of Akt protein in pachymic acid group was significantly higher than that in modelgroup（ P< 0.05 ）. Conclusions Pachymic acid can significantly improve the myocardial inflammation and injury in mice with viral my-ocarditis， and its mechanism may be up-regulating the expression of Akt protein and activating PI3-K/ Akt signal transduction pathway.

[ Key words ] Pachymic acid; Viral myocarditis; CoxsackievirusB3;Caspase-3; Akt

病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）是临床常见疾病之一，在VMC的发生发展中，病毒直接感染损伤心肌，进而又导致机体免疫系统激活造成自体心肌被自体免疫系统杀伤，心肌细胞坏死、凋亡，最终造成不可逆损害[1～3]。茯苓酸是存在于茯苓、灵芝等中药材中的一种三萜类化合物，具有多种生物、化学作用[4]。研究表明，茯苓酸可以阻断T细胞介异的细胞免疫反应，从而降低CD8+淋巴细胞诱异的细胞凋亡[5]。本研究采用茯苓中提取三萜类化合物茯苓酸[3β乙酰氧基16a羟基羊毛甾8，24（31）二烯21酸，Pachymicacid，PA），观测在BALB/c小鼠VMC动物模型中的疗效以及对Caspase-3和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）在VMC表达水平的影响，为临床VMC的药物治疗提供新的依据。

1材料与方法

1.1材料：由哈尔滨医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（黑）2013-021），4周龄健康雄性SPF级BALB/c小鼠150只，体重15～17g;茯苓酸，自制，由郑州大学检测质量合格，溶于二甲亚砜配制成1mg/mL的茯苓酸药液;柯萨奇病毒B3（CVB）m株，Hep2细胞中传代，CPE达75%时收获，其滴度为107TCID50/0.1mL;Caspase-3试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。病理切片显微镜及分析系统：OlympusJVCTK-C1381彩色成像显微镜观测、记录数据MoticImages2000Version1.3软件进行分析。

1.2实验方法：

1.2.1动物分组及模型建立：将150只入选小鼠按随机数字表法分为三组，每组50只。正常对照组：正常小鼠不给予病毒，每只小鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.1mL/g;模型对照组：每只小鼠给予腹腔注射107TCID50（CVB）0.1mL/g，注射病毒2h后再注射0.9%氯化钠溶液0.1mL/g;茯苓酸组：每只小鼠给予腹腔注射107TCID50（CVB）0.1mL/g，注射病毒2h后再注射茯苓酸药液0.1mL/go以上小鼠腹腔注射柯萨奇病毒3d，药物治疗15d，记录小鼠15d内生长情况。小鼠在造模过程中可能出现死亡情况，为便于后.续实验正常进行，分别于第4d、8d、15d从各组小鼠中随机取出8只进行考察，乙醚麻醉，分离出心脏待用。1.2.2-般情况观察及死亡统计：自模型建立后，每天观察各组小鼠的精神、食欲、活动及其他症状，记录每组死亡小鼠的时间及数量。

1.2.3标本采集及组织病理学检测：在造模后的第4d、8d、15d各个时间点取出小鼠心脏，观察大体变化，将其分成两部分，取少量组织用10%甲醛固定，用以制作光学显微镜检测用标本，其余心肌组织研磨形成单细胞液，并裂解其中心肌细胞。小鼠心脏切片行常规HE染色，光镜显微镜下观察小鼠心肌病理变化，每张切片取5个高倍视野，采用Rexkalla半定量分析法[6]计算每个视野下的炎性细胞浸润、心肌坏死面积所占整个心肌面积百分比。心肌病变积分标准：炎性细胞浸润、心肌坏死>75%计4分，50%～75%计3分，25%～50%计2分，<25%计1分，无炎性细胞浸润、心肌坏死计0分。

1.2.4Caspase-3酶活性及Akt蛋白表达检测：将小.鼠心肌组织加入裂解液，研磨成匀浆，离心，获得总蛋白，按照Caspase-3酶活性检测试剂盒相关步骤测定，加底物显色后于405nm处绘制pNA标准曲线，同时采用酶标仪测定相同波长下样品的光密度值，根据标准曲线方程及光密度值计算样品中Caspase-3酶活性;Akt蛋白表达采用Westernblotting法进行检测，BCA试剂盒测定小鼠心肌组织蛋白浓度后，与蛋白.上样缓冲液混合，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，用PVDF膜对凝胶条块进行转膜，5%脱脂奶粉室温摇床封闭1.5h后，分别加入兔抗多克隆-抗，4°C孵育过夜，洗膜4次，二抗室温孵育1h，洗膜4次，于凝胶系统中曝光显影，以β-actin为内参，计算Akt蛋白的相对表达量。

1.3统计学处理：数据采用SPSS15.0统计学软件分析处理，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验;计数资料以率表示，采用x2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1小鼠死亡情况比较：实验过程中，正常对照组15d内未出现死亡现象;模型对照组8d内死亡9只，15d内死亡16只，死亡率达到32.00%;茯苓酸组8d内死亡6只，15d死亡7只，死亡率达到14.00%。对比各组小鼠15d内死亡率情况，发现茯苓酸组小鼠死亡率显著低于模型对照组（x2=4.57，P<0.05）。

2.2小鼠心肌组织病理学变化：观察第15d各组小鼠心肌组织病理情况，结果显示，正常对照组心肌组织结构正常，未见细胞坏死及炎性细胞浸润（图1a见封三），模型对照组小鼠见心肌组织及心外膜下炎细胞浸润，大片的心肌坏死，溶解，钙化（图1b见封三），茯苓酸组小鼠心肌组织可见少量的炎性细胞浸润，肌溶少，有横纹，心肌纤维排列紊乱松散（图1c见封三）。

采用Rezkalla半定量分析法评估小鼠心肌病变积分，模型对照组小鼠在实验第4d，8d，15d心肌病变积分显著高于正常对照组（P<0.05），但采用茯苓酸進行治疗后，茯苓酸组小鼠各时间段心肌病变积分相较模型对照组有所降低（P<0.05），见表1。

2.3小鼠心肌组织Caspase-3检测结果比较：见表2。在实验第4d、8d、15d，模型对照组小鼠心肌组织Caspase-3活性较正常对照组显著升高，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05），茯苓酸组较模型对照组Caspase-3活性有所降低，但二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4小鼠心肌组织Akt蛋白表达水平比较：采用蛋白免疫印迹技术检测各组小鼠心肌组织中Akt蛋白表达，结果发现，与正常对照组比较，模型对照组小鼠第4d、8d、15d心肌组织中p-Akt蛋白表达显著降低（P<0.05），与模型对照组比较，茯苓酸组各时间点心肌组.织p-Akt蛋白表达均显著升高（P<0.05），见表3。

3讨论

VMC作为一种病毒感染性心肌炎性病症，是引起青少年心力衰竭、心源性休克和猝死的主要原因[7，8]。对于VMC这种致死率較高的疾病，目前临床上相关的有效治疗方案较为有限，部分研究报道黄芪、虎杖等复方中药对VMC的治疗可能有效，但其具体作用机制尚不十分清楚，因此探究VMC的发病机制及有效治疗手段仍是目前临床医学研究中关注的重点和难点。

茯苓酸是存在于茯苓、灵芝等中药材中的一种三萜类化合物，具有维持细胞稳定、抗炎、抗肿瘤细胞等多种生物学作用[6，9，10]。刘宏宇等[11]证实茯苓酸可通过竞争性抑制磷脂酶A2（PLA2）的生物活性，增加外周血中CD4+和CD8+淋巴细胞的数量，保护细胞，

免受损伤。本研究发现茯苓酸可明显提高科萨奇B病毒3所致的病毒性心肌炎（CVB3-VMC）小鼠的生存率，同时其对CVB3-VMC小鼠的心肌细胞有明显的保护作用。

近年来越来越多的研究表明，细胞凋亡作为一种细胞程序性死亡在VMC的发生及发展过程扮演着重要的角色。病毒感染后所致心肌细胞凋亡可引起心肌细胞丢失，最终导致心功能出现障碍[12]。尽管VMC引起的细胞凋亡机制目前尚不清楚，但已有研究表明，抑制心肌组织中Caspase-3的表达对心肌细胞凋亡具有一定的缓解作用。颜雯等[13]在CVB3感染的小鼠原代心肌细胞中加人雷米普利进行培养，发现感染病毒的心肌细胞凋亡率显著降低，且Caspase-3蛋白表达显著下降，进一步揭示雷米普利抑制心肌细胞凋亡可通过下调Caspase-3的表达来实现。本实验通过采用Caspase-3活性检测试剂盒测定小鼠心肌组织中Caspase-3含量，结果显示，模型对照组小鼠Caspase-3含量较正常对照组显著升高，茯苓酸组小鼠Caspase-3含量较模型对照组有所下降，但是两组比较差异无统计学意义（P>0.05），探究原因，可能是茯苓酸在BALB/c小鼠这种活体动物中对Caspase-3的调节无明显作用，同时可能是因为样本量太少，实验数据不足以正确说明问题，因此茯苓酸对病毒性心肌炎小鼠的心肌保护是否通过抑制Caspase-3介导的细胞凋亡途径来发挥作用仍有待后续进一步研究。

Akt是PI3K信号传导途径中极其重要的靶蛋白，处于PI3K/Akt信号通路的中心环节[14]。在细胞代谢过程中，Akt与PIP3结合后，实现从细胞质到细胞膜转位，Akt发生活化，活化后的Akt可通过磷酸化一系列下游靶蛋白来行使各种细胞功能，以此达到抑制.细胞凋亡的作用。本试验通过蛋白免疫印迹技术测定各组小鼠心肌组织中Akt蛋白的表达，结果显示，模型组小鼠心肌组织中p-Akt蛋白在实验第4d、8d、15d较正常对照组显著降低，而在对应时间点茯苓酸组小鼠心肌组织中p-Akt蛋白表达均显著升高，组间.比较差异具有统计学意义（P<0.05），这说明茯苓酸保护VMC小鼠的心肌损伤可能是通过上调Akt蛋白的表达，激活PI3～K/Akt信号转导通路来实现的。

综上所述，本研究初步证实，茯苓酸作为中药茯苓中的一种有效活性成分，对VMC小鼠具有一定保护作用，其作用机制可能与PI3-K/Akt信号中Akt蛋白表达的上调有关，但因受实验样本数量所限，上述结果还有待大样本的试验来进一步证实。

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（收稿日期：2019-4-9）