微生物检测中ATP生物发光法的应用研究现状

易琳

（西华师范大学生命科学学院，四川南充 637000）

人类的身体健康、生命安全长期受到微生物污染的威胁，营养琼脂平板计数法是国际上针对微生物检测的现有标准方法，然而该方法要求在37 ℃下持续培养48 h，过于繁琐的操作无法实现快速检测。现下，国内也加大了对核酸法、电阻抗测量、免疫学方法、微菌落技术等各类微生物快速检测技术展开了研究、应用。ATP生物发光法因快速、简便且具有较高灵敏度的缘故，可用于实时监控微生物污染，与食品行业需求相符合，故而有关该技术的研究与应用十分广泛。

1 食品检验中现代生物技术应用的重要性

品质较高的食品安全检验能为食品提供一定的安全性保障。我国近年来逐渐加大了有关食品安全问题的重视程度，在现代生物理论的运用下，促使现代生物技术获得了更为广泛的运用领域[1]。同时，近年来生物技术的快速发展，使其得以在实现精确测试检验的基础上，也具备了安全、环保等特点，十分适用于食品安全检验。传统生物及食品检验技术难以为食品提供可靠的安全性保障，这也进一步凸显了现代生物技术的发展前景。鉴于此，本文深入探究了ATP生物发光法在微生物检测中的运用。

2 ATP生物发光技术检测微生物的原理及一般步骤

ATP生物发光技术是在Mg2+和荧光素酶E的作用下，ATP与荧光素LH2产生腺苷酰化被活化，而荧光素在被活化后结合荧光素酶会有荧光素—AMP复合体形成，且会有焦磷酸（PPi）产生。当分子氧将复合体氧化后，会有激发态复合物P*-AMP形成，并有CO2产生。而该复合物由激发态朝着基态转化期间会有光射出，最终会有氧化冲荧光素P和AMP形成。具体反应过程如下：

就ATP生物发光技术而言，其检测步骤通常为：首先对ATP生物发光值及样品微生物含量标准曲线进行绘制，随后在取样、ATP提取、酶反应试剂添加、样品微生物ATP发光值测定完成之后，以标准曲线为根据对样品中微生物实际数值进行测定。

3 ATP生物发光法的优缺点

ATP生物发光法主要包含简便、快速及较好重现性等优点。但是，因其对样品提出了至少1 000个/mL细菌浓度的要求，故而无法将卫生学提出的有关灵敏度的要求有效满足。同时也有ATP生物发光法无法对微生物及非微生物的ATP进行区分等缺点[2]。ATP生物发光法优缺点及应用范围见表1、表2。

表1 ATP生物发光法优缺点

表2 ATP生物发光法应用范围

4 ATP生物发光技术在食品微生物检测中的应用——以酸奶Fe3O4检测为例

4.1 试验方法

化学发光检测：取出1.0μ mol的氨基改性Fe3O4纳米粒子，采用吡啶缓冲液反复清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室温环境下持续3h振荡。加入ATP适体10 pmol，置于室温环境下持续振荡1 h。采用WB清洗液反复清洗后，在其内加入2% BSA溶液200μL，置于室温环境下持续振荡1 h。再次采用WB清洗液反复清洗后，将Fe3O4纳米粒子移入100 μL ATP中（浓度为2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、6 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L），置于室温环境下持续振荡1 h[3]。再次采用WB清洗液反复清洗后磁性分离，借助超纯水将Fe3O4纳米粒子朝着一端开口的圆柱形玻璃瓶内转移，并置于BPCL微弱发光仪中，加入90 μL荧光素酶缓冲液，对其荧光发光强度进行测量，最终信号值以最高信号值出现后10 s的积分值为主。

借助化学发光法检测ATP特异性并开展干扰性实验：取出1.0 μmol的氨基改性Fe3O4纳米粒子，采用吡啶缓冲液反复清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室温环境下持续3h振荡。加入10 pmol ATP适体在室温环境下持续振荡1h。采用WB清洗液反复清洗后，在其内加入200μL 2% BSA溶液，置于室温环境下持续振荡1h。借助WB清洗液再次清洗后，在CTP溶液（100μL）、UTP溶液（100μL）、GTP溶液（100μL）、ATP和CTP混合液、ATP和GTP混合液、空白AA缓冲液中加入ATP溶液（10μmol/L），置于室温环节下持续1h振荡[4]。采用WB清洗液反复清洗后磁性分离。借助超纯水将Fe3O4纳米粒子朝着一端开口的圆柱形玻璃瓶内转移，并置于BPCL微弱发光仪中，加入90μL荧光素酶缓冲液，对其荧光强度进行测量。

4.2 结果

依据上述检测结果完成曲线图的绘制。根据图1能发现，R2=0.996 3时，具有良好的线性范围，在ATP定量检测中十分适用。在CTP、GTP、UTP溶液中，表现出较低荧光强度；而在ATP、CTP、GTP、UTP混合溶液中，荧光强度所受到的影响并不大，实验具有较高可行性。

图1 化学发光检测ATP工作曲线

在测定酸奶中ATP时，将乳酸菌中ATP提取后，以Fe3O4纳米粒子作为实验对象，依据化学发光法对其发光值检测，依据特性完成ATP捕获[5]。依据试验结果得知，随着乳酸菌含量的增加，化学发光值及ATP提取量也在上升，实验存在较为突出的重复性。通过图2了解到，每mL酸奶乳酸菌中含有3.98×10-8mol ATP量。故而，针对本试验中的Fe3O4纳米粒子而言，可在视频分析检测领域中作为载体使用。

图2 不同溶液中ATP发光值的测定

5 结论

ATP发生发光法相对于其他微生物快速检测方法而言，因简单、快速便捷及较高灵敏度等优点的缘故，优势十分突出，被广泛运用于食品加工行业之中[6]。然而，由于外界因素极易对该方法造成干扰的缘故，对于微生物种类无法实现定性鉴别，在直接检测个别样品时也无法将要求的灵敏度实现[7]。故而，ATP提取剂的合理选择、外界因素干扰的降低、微生物特异性识别的增强及检测灵敏度的提高成为了该方法进一步改善及深入研究的重要方向。

ATP生物发光法具备103CFU/mL的检测限，然而大部分致病菌却呈现出10 CFU/mL的致病浓度。因免疫磁分离技术（IMS）可将浓缩、选择性分离等作用发挥在样品中，故而将ATP生物发光法与IMS技术结合后对细菌进行检测，不但可将外界因素干扰降低，同时也能对微生物进行特异性识别，可实现检测灵敏度的有效提升[8]。同时，针对荧光毛细分析法而言，在发光检测仪中引入毛细管可实现小型化。在不断发展的科技技术下，ATP生物发光法必然能够更为成熟、完善，其应用领域、范围也必然会不断扩大。