微生物法检测实验动物血清中的抗生素残留

钟克焱，甘杨子

（海南医学院，海南海口 571199）

实验动物在饲养、实验过程中常使用抗生素，这不可避免地会导致实验动物血液中存在抗生素及其代谢产物会残留一段时间，这可能会影响后续实验[1]。有抗生素残留的动物本身并不是合格的实验动物，抗生素残留可能会干扰实验的结果。因此，对实验动物血清中的抗生素残留检测，主要采用液相色谱、质谱分析等，但是这些分析方法更适合进行量化分析，同时价格也相对更高。微生物法检验是一种传统经典的测定方法，其利用抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，与阴性对照进行对比，反映待测样本中是否存在抗生素残留。微生物检测法包括括纸片法、TTC法、管碟法、试剂盒检测法，这些方法操作简单，可供选择的是检测试剂材料丰富，可读性强，许多甚至通过肉眼便可以观看微生物的孢子萌发是否受到抑制，从而判断是否存在抗生素残留。本文尝试采用实验动物血清中的抗生素残留，为抗生素残留检测方法建立提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器设备、材料

选择实验室SD大鼠，数量不限，麻醉后取股动脉血，-4 ℃保存，获得血液100份，每只1 mL。嗜热脂肪芽孢杆菌，青霉素等抗生素，甲苯胺蓝，MRS肉汤培养基等。电子天平，电热恒温水浴锅，酸度计，生化培养箱，生物学显微镜，不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅等。

1.2 方法

以嗜热脂肪芽孢杆菌作为检测菌种，根据药典中有关于抗生素残留微生物检测方法国家标准，参照管碟法检测不同抗生素的检测限，以新生大鼠血清作为阴性对照。以高效液相色谱-串联质谱法測测定实验动物中的兽用抗生素的有效含量。抗生素标准储备液及工作溶液的稀释剂的选择参考国家标准检測方法中所用稀释剂。采用嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法制备含有不同抗生素含量的血液样品，以检出阳性的最低限度抗生素浓度作为嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法对该种抗生素的检出限。分别采用LPLC-MS/MS、嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检测随机获得的415份实验动物血液，以LPLC-MS/MS作为金标准，评价嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检测抗生素残留效用。

1.3 观察指标

LPLC-MS/MS测定的商品抗生素含量、嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法测定抗生素的检出限度。实测过程LPLC-MS/MS法。

2 结果

2.1 检出限比较

LPLC-MS/MS测定的商品抗生素含量、嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法测定抗生素的检出限度如下，见表1。

2.2 实测

以LPLC-MS/MS作为金标准，测定415份实验动物血液样本，其中阳性72例、阴性343例，嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法的灵敏度84.7%（61/72）、特异度99.1%（340/343）、阳性预测值95.3%（61/64）、阴性预测值96.9%（340/351）、符合率96.6%（401/415）。

表1 两种方法测定实验动物血液中抗生素的检出限度

3 讨论

实验动物血清抗生素残留的检测是实验室动物管理的重要组成部分，可以反应实验动物供应机构的饲养情况、质控水平[2-3]。微生物法是抗生素残留检测重要方法，但是精度常无法让人满意，需要明确检测限度，建立检测体系。本文选择指南推荐的嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法进行研究，以LPLC-MS/MS作为金标准，尝试建立嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检测体系。

研究显示，微生物法检测实验动物血清中的抗生素残留的效用尚可，尽管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以满足部分抗生素检测的需求，可以作为快速检测法。以金标准作为检测对照，嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法的灵敏度84.7%、特异度99.1%、阳性预测值95.3%、阴性预测值96.9%、符合率96.6%，反映了嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法可以快速检测抗生素残留，且效用较好，从检出效率来看，理想状态下与LPLCMS/MS法接近。从检出限度大小变化来看，该方法与LPLC-MS/MS法检测限度有相关性，即抑菌法检测限度越高，一般LPLC-MS/MS法限度也越高，但嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法对头孢噻呋钠、苄星青霉亲、红霉素的检测限度较低，这与检测菌的耐药性、受抑制抗生素作用的特性有关[4]。

但需注意的是，研究中，嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法对各类抗生素残留检测限度在3～70ng/g之间，存在较大的差异。本次研究中嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法对头孢氨苄等抗生素的检出限度较高，这反映了微生物抑制法存在固有的缺陷，检测精度达不到国家的要求。因此，在选择检测菌时，需尽量选择那些耐药性较低、对抗生素普遍敏感的微生物，如嗜热脂肪芽孢杆菌。也可以尝试联合其他微生物抑菌法，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌检出限度较高的头孢噻呋钠、苄星青霉亲、红霉素等抗生素敏感的指示菌，建立实验动物抗生素残留的检测体系，以覆盖绝大多数的兽用抗生素。当然，不同实验室实验动物的来源不同，对质量要求也不同，建立抗生素残留检测体系需要根据自身的实际需要[4-5]。

本次研究也存在许多不足之处，实验得出的结果是理想条件下单一抗生素残留检测。在实践过程中，实验动物体内可能会存在多种抗生素，这些抗生素混杂会干扰检测结果，嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法对于多种抗生素残留检测效果并不理想[6-7]。

4 小结

微生物法检测实验动物血清中的抗生素残留的效用尚可，尽管不如LPLC-MS/MS法，但是基本可以满足检测的需求，可以作为抗生素含量快速检测。