Alcalase蛋白酶对草鱼鱼鳞胶原多肽提取的研究

2019-04-10赵莎

生物化工 2019年1期

赵莎

（西安培华学院，陕西西安 710125）

胶原蛋白广泛存在于各种生物体，因其生物相容性和低抗原性而广泛应用于食品、保健食品等多个领域[1]。鱼鳞的相对分子质量大且分子结构复杂，其水解物胶原多肽相对分子质量低、渗透性好、亲水性强而应用广泛。我国是当今世界淡水养殖业最为发达的国家之一，据统计每年淡水鱼加工业的废弃物中鱼鳞约为30万吨[2]。有关研究表明，鱼鳞的主要成分为胶原蛋白，占鱼鳞总质量的50%～70%[3]。草鱼作为四大家鱼之一，其水产品加工产生大量鱼鳞、鱼骨等废弃物[4]，为了充分利用这些废弃物，本研究以草鱼鱼鳞为原料，对Alcalase蛋白酶制备鱼鳞胶原多肽的水解工艺进行初步研究。

1 实验材料与设备

1.1 材料与试剂

草鱼鱼鳞，购于西安培华学院门口菜市场；Alcalase碱性蛋白酶（2.4 AU/g），意诺联创生物科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热鼓风干燥箱仪器，上海一恒科学仪器有限公司生产；GL-20G-Ⅱ高速离心机，上海安亭科学仪器厂生产；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产。

2 实验方法

2.1 脱钙鱼鳞的制备

将草鱼鱼鳞取纯净水清洗干净，用纱布吸干表面水分，去除鱼皮和鱼肉，加入15倍体积的0.4 mol/L盐酸，室温反应3 h后，再用纯净水清洗，再放置鼓风干燥箱烘干，脱钙鱼鳞制备完成。

2.2 Alcalase蛋白酶对草鱼鱼鳞提取草鱼鱼鳞胶原多肽粉

将烘干的草鱼脱钙鱼鳞进行预处理，Alcalase蛋白酶对其进行水解再进行灭酶，酶解结束后用0.3%活性炭进行去腥、脱色，再进行高速离心后取上清液进行冷冻干燥，干燥后即为所得到的胶原多肽粉。

2.3 预处理温度对胶原多肽提取的影响

称取10 g处理过的脱钙鱼鳞，加入100 mL ddH2O，分别于50 ℃、100 ℃及121 ℃加热10 min，然后于加酶量为0.07 AU/g，底物质量分数为5%，在60 ℃条件下反应3 h左右。

2.4 酶解胶原多肽最佳工艺的研究

2.4.1 加酶量对胶原多肽提取率的影响

用电子天平称取10 g脱钙鱼鳞，加100 mL ddH2O，于121 ℃条件下预处理10 min，再分别加入浓度为0.02、0.04、0.06、0.08 AU/g和0.10 AU/g的Alcalase蛋白酶，在60 ℃条件下反应3 h，彻底水解后进行灭酶（100 ℃水浴10 min），酶解结束后0.3%活性炭进行去腥、脱色，后于4 000 r/min离心10 min，取上清液10 mL进行酶解消化，再用凯氏定氮法测定多肽含量。

2.4.2 酶解时间对胶原多肽提取率的影响

取10 g脱钙鱼鳞混合于100 mL ddH2O中，于121 ℃预处理10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，于60℃反应1、1.5、2、2.5、3、3.5 h及4 h，后续操作同2.4.1。

2.4.3 酶解温度对胶原多肽提取率的影响

用电子天平称取10 g处理好的脱钙草鱼鱼鳞，加至 100 mL ddH2O中，于121 ℃预处理 10 min，然后加入0.07 AU/g的Alcalase蛋白酶，分别于40、45、50、55、60、65 ℃和70 ℃温度下保温3 h，后续操作同2.4.1。

2.4.4 底物质量分数对胶原多肽提取率的影响

分别称取 5、10、15、20 g及25 g处理好的脱钙草鱼鱼鳞，分别加入100 mL ddH2O并充分混合，预处理条件为121 ℃、10 min，再加入Alcalase蛋白酶的量为0.07 AU/g，于60 ℃反应3 h，后续操作同2.4.1。

3 结果与分析

3.1 预处理温度对酶解作用的影响

将10 g脱钙鲤鱼鱼鳞与100 mL ddH2O蒸馏水混匀，分别于50 ℃、100 ℃和121 ℃条件加热10 min，按照上述加酶量取适量Alcalase蛋白酶，底物浓度15%、60 ℃条件下反应3 h，鱼鳞胶原多肽提取率如图1所示。由图1得出，鱼鳞胶原多肽提取率会随着温度的升高而显著增加。造成这种原因可能是由于随着压力和温度的升高，胶原蛋白多肽链的空间结构变性，有利于Alcalase蛋白酶对其水解作用。

图1 预处理温度对胶原多肽提取的影响

3.2 胶原多肽酶解工艺研究

3.2.1 加酶量对蛋白提取率的影响

从图2可知，加酶量在0.02～0.07 AU/g时，增加加酶量使得蛋白的提取率显著增长，出现这种情况的原因可能是增加加酶量会使得酶与底物结合的概率加大，其水解程度明显增强。当加酶量达到0.07 AU/g时，胶原蛋白提取率达到最高，后再增加加酶量提取率降低，这可能由于加酶量达到一定程度将几乎所有反应底物彻底反应掉[5]。反应底物已耗尽，增加酶量无法使水解度得到显著提高，因此选择最佳加酶量为0.07 AU/g。

3.2.2 酶解时间对蛋白提取率的影响

由图3可知，Alcalase碱性蛋白酶在催化反应前期存在较高活性，在约3 h时鱼鳞胶原蛋白进行酶解提取率最高。随着酶解时间的增加，胶原蛋白的提取率不变，可能是3 h以后胶原蛋白质量分数比较高导致提取液变黏稠，阻止了酶与底物接触，再增加反应时间也不会使得胶原蛋白含量显著升高[6]。因此，选择3 h为最佳时间。

图2 Alcalase蛋白酶加酶量对胶原多肽提取率的影响

图3 Alcalase蛋白酶酶解时间对胶原多肽提取率的影响

3.2.3 酶解温度对蛋白提取率的影响

实验得出酶解温度在50～60 ℃时，酶解液中蛋白质含量明显升高，达到60 ℃时，蛋白质提取率可达到最高。随着酶解温度继续升高，酶解速度逐渐下降，可能是在酶最适温度以下，随着温度的升高反应物的能量和分子间有效接触的频率增加。当温度过高酶分子吸收了过多能量，维持酶蛋白分子的次级键断裂，使得Alcalase酶蛋白变性，酶活性由此降低甚至丧失。选择60 ℃为最佳酶解温度。

3.2.4 底物质量分数对蛋白提取率的影响

实验得出在反应底物质量分数越高，提取率增长越快，在15%的底物质量分数条件下，Alcalase蛋白酶酶解达到最高。随着反应底物的质量分数继续增高，胶原蛋白提取率几乎不变。这可能是由于底物质量分数过高，引起水解反应液黏度过高，从而影响蛋白酶与底物的接触，酶解反应速度降低并抑制水解反应。因此，选择15%为反应底物质量分数。