转录因子Snail对胃癌MKN-28细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响
2019-04-10武平
武平
(山西医科大学晋祠学院,山西太原 030025)
胃癌属于恶性肿瘤的一种,其发生率较高,并具有较高的致死率,严重威胁患者的健康及安全[1]。研究显示,晚期胃癌患者死亡的一项重要原因即肿瘤细胞侵袭与转移。因此,了解胃癌的发生情况,同时分析其侵袭、转移机制,可为该病患者的治疗提供有效参考[2-3]。Snail是一种锌指蛋白转录因子,该因子在多种肿瘤疾病中均可发挥一定作用[4]。本研究就转录因子Snail对胃癌MKN-28细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响进行了分析。
1 材料与方法
1.1 实验材料
自上海细胞库选购胃癌MNK-28细胞株,选取基尔顿公司合成的慢病毒构建针对Snail设计的shRNA载体;同时选取CCK-8试剂盒(生产厂家:凯基公司)、Transwell小室(生产厂家:康宁公司),顺铂及其他试剂、培养基均由博尔美公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
于37 ℃、5%二氧化碳水平下,以PRMI 1640培养基(含10%胎牛血清)对MNK-28细胞进行培养;严密观察细胞情况、定时换液,细胞密度达到80%时以胰酶消化处理,继续培养。
1.2.2 筛选药物浓度
取对数生长期的胃癌MNK-28细胞株,将选取的细胞株加至96孔板中,每孔加入100 μL悬浊液,密度设置为1×104个/mL,连续培养24 h;分别在孔中加入2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的顺铂,培养时间分别为12 h、24 h、48 h;同时每孔中加入10 μL CCK-8;然后于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中继续培育2 h,之后利用酶标仪进行450 nm波长的吸光度值(OD值)测定;每组细胞均分别设置3个复孔。
1.2.3 细胞增殖情况观察
细胞增殖情况以CCK-8法观察,在96孔板中加入对数生长期的MKN-28细胞,每孔中加入细胞悬液100 μL,确保每孔细胞密度为1×104个/mL;并设置复孔,继续培养24 h,之后加入顺铂、shRNA+Snail、shRNA+Snail+顺铂等处理因素,继续进行培养;每孔加入10 μL CCK-8,于培养箱中培养2 h,以空白对照标零,利用酶标仪进行吸光度值测定。
1.2.4 细胞凋亡情况观察
以电镜观察细胞凋亡情况,在96孔板中加入密度为4×105个/mL的MKN-28细胞,并加入相关刺激因素,培养48 h,以胰酶消化细胞,离心10 min,弃上清液,以Palade缓冲液进行2次洗涤,洗涤后在1%锇酸中悬浮细胞,固定于4 ℃环境下1 h,再以相同缓冲液进行洗涤2次。之后进行脱水处理,脱水后在丙酮/包埋剂置换30 min,置换后在包埋剂中浸润2 h,之后进行包埋、切片、染色等处理,最后于电子显微镜下对细胞情况进行观察。
1.2.5 细胞侵袭情况观察
对细胞侵袭情况进行分析,观察方式选用Transwell小室,收集经相关因素刺激后的对数生长期细胞,调整细胞密度至2×105个/mL,在Transwell小室上部接种,在37 ℃环境下培养24 h;之后将Transwell膜取出,反复洗涤,并用4%多聚甲醛固定15 min,用0.1%结晶染色10 min;最后于显微镜下进行拍照观察,统计穿过Transwell膜的细胞数量。
1.3 统计学分析
以SPSS20.0统计学软件对数据资料进行处理,计量资料“±”以t检验,计数资料(%)以χ2检验,p<0.05为有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 药物浓度筛选结果分析
以酶标仪进行OD值测量,以OD值表示细胞存活率,MKN-28细胞在经不同浓度的顺铂培养48 h后,其细胞存活率均明显降低,且随着顺铂浓度的增加,其细胞存活率逐渐下降。经分析,于5 μg/mL、作用48 h时杀伤效率最理想,见表1。
表1 药物浓度筛选结果
2.2 沉默Snail基因对MNK-28细胞增殖情况的影响
经CCK-8法对各组MNK-28细胞增殖能力进行观察,以OD值表示细胞增殖能力,作用48 h后进行比较,顺铂处理及慢病毒沉默Snail基因均可见细胞增殖抑制现象,而shRNA+Snail+顺铂组细胞增殖抑制率显著高于其他组(p<0.05),见表2。
表2 沉默Snail基因对MNK-28细胞增殖情况的影响
2.3 沉默Snail基因对MNK-28细胞凋亡的影响
于电镜下对细胞凋亡情况观察分析,可以观察到内皮网明显稀疏,细胞质明显浓缩,内质网稀疏,并和细胞膜融合形成空泡,细胞核也明显缩小,同时线粒体体积变大,并可见已凋亡细胞发生裂解,构成凋亡小体。shRNA+Snail+顺铂组凋亡小体相较于其他组别,表现地更为明显,见图1。
图1 细胞凋亡情况观察
2.4 沉默Snail基因对MNK-28细胞侵袭情况的影响
以Transwell小室观察细胞侵袭情况,以穿过Transwell膜的细胞数量进行表示,以OD值进行计数,shRNA+Snail+顺铂组细胞迁出的细胞数较其他组明显降低(p<0.05),见表3。
表3 沉默Snail基因对MNK-28细胞侵袭情况的影响
3 讨论
胃癌属于恶性肿瘤性疾病的一种,起源于胃黏膜上皮,其发生率较高,占据了我国各种肿瘤的首位[5]。该病患者多为50岁以上的中老年人群,且男性的发生率约为女性的2倍[6]。近年来,随着人们生活习惯、饮食结构的改变及工作压力的增大,该病的发生率呈明显增长趋势。该病发生早期通常无明显症状,极易被患者忽略,多数患者就诊时已处于晚期状态。手术是目前临床上治疗胃癌的常用方式,但术后患者复发及转移率较高,通常可达到40%~60%。而胃癌转移属于胃癌的重要特征,是导致患者死亡的重要因素[7]。故而加强对胃癌侵袭、转移的研究非常重要。
Snail属于锌指蛋白转录因子的一种,定位于人类染色体20q12.3。有研究表明,Snail在小鼠结肠癌肿瘤细胞凋亡及增殖中发挥着重要作用。同时有研究显示[8],Snail能够调节细胞周期蛋白CyclinD2,且其异常表达还可能会影响p53及一些促凋亡因子表达情况,进而可对肿瘤生长造成影响。
本次研究分析了Snail对胃癌MKN-28细胞增殖、凋亡及侵袭的影响,结果显示顺铂处理及慢病毒沉默Snail基因均可见细胞增殖抑制现象,而shRNA+Snail+顺铂组其细胞增殖抑制率显著高于其他组(p<0.05);与单纯MKN-28细胞组比较,不同刺激因素组细胞凋亡程度均显著升高(p<0.05);这说明,Snail可对胃癌MKN-28细胞的增殖与凋亡造成影响。
胃癌细胞转移与浸润属于复杂过程,常会涉及较多方面,如细胞自原发病灶中脱落,并将基底膜浸润、穿透,细胞之间黏附力不同,可对浸润造成影响[9]等。从实质上说,癌细胞的浸润和转移是黏附和去黏附的交替过程,其和E-cadherin的表达之间密切相关。上皮间质转换则在胚胎时期器官发育过程中承担着重要职责,和肿瘤局部浸润、侵袭能力均有较大关联,而E-cadherin为上皮细胞的关键分子,其表达水平下降则为其典型表现,Snail基因则可对其表达情况进行调节[10]。本次研究结果显示,经Snail基因调节后,各组细胞侵袭能力均有所下降,且shRNA+Snail+顺铂组细胞迁出的细胞数较其他组明显降低(p<0.05);提示Snail可在一定程度上对细胞侵袭能力造成影响,而Snail可能会在一定程度上提高顺铂的活性。
综上所述,转录因子Snail可对胃癌MKN-28细胞的增殖情况产生影响,沉默Snail基因有利于加速细胞凋亡,提高化疗药敏感性,有较好的临床应用前景。