钴铬合金经有机硅季铵盐浸泡后对白色念珠菌黏附的影响

刘辉明 廉云敏 高岚 王璞

050000石家庄， 河北医科大学第二医院口腔修复科

目前，我国已经进入老龄化社会，临床上因牙齿缺失需要可摘义齿修复治疗的老年患者人数不断增加。因长期佩戴义齿而引起义齿性口炎的发病率也逐渐增高。钴铬合金基托具有硬度高、弹性模量大、制作简便等优点以及其价格优势，目前仍广泛应用于临床。但由于其不易磨平和抛光，容易积聚细菌而形成菌斑。因此，本实验拟用有机硅季铵盐浸泡处理钴铬合金以提高其表面的抗黏附性，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

钴铬合金(登士柏,美国)；二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(山东爱普化学有限公司)；电热恒温干燥箱(101-0S，绍兴苏珀仪器有限公司)；浊度仪(梅里埃公司，法国); 冷热循环仪( TC-501-F，苏州威尔实验用品有限公司) 。

1.2 实验菌株和培养基

白色念珠菌 ATCC90028(温州康泰生物科技有限公司)；沙保罗琼脂固体培养基(温州康泰生物科技有限公司)；灭菌1640液体培养基(不含酚红)(Life Technologies，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 制作试件 本实验采用失蜡法制作10 mm×10 mm×1 mm试件。检查合格后，依次使用200、 360、 400、 600目砂纸逐级对试件的6 个面进行打磨，每个面50 次。然后用灭菌蒸馏水超声清洗10 min, 而后用95%乙醇超声清洗10 min(重复2 次)脱脂，最后用灭菌蒸馏水冲洗，吹干，高温高压灭菌后备用。

1.3.2 硅烷膜制备 随机选取144 片灭菌试件分为A～F 6 个不同浓度处理组：A组：1%有机硅季铵盐溶液；B组：5%有机硅季铵盐溶液；C组：10%有机硅季铵盐溶液； D组：30%有机硅季铵盐溶液； E组：60%有机硅季铵盐溶液；F组：灭菌蒸馏水，即为对照组。再将各大组随机分为4 个不同处理时间组，分别为30、 60、 120、 240 min。浸泡处理后，取出试件，漂洗去除试件表面悬浮的溶液，吹干。然后将电热恒温干燥箱调至120 ℃恒温，将处理后的试件放入恒温干燥箱中60 min固化成膜[1]后，放入无菌24 孔细胞培养板中备用。

1.3.3 菌悬液制备 将白色念珠菌ATCC90028复苏后，用无菌棉签挑取菌落，然后用无菌的1640液体培养基稀释，吹打混匀后，比浊仪调整，配置成1.5×108CFU/ml的菌悬液备用。比浊前，使用无菌的1640液体培养基作空白对照， 调“0”。

1.3.4 抗黏附性实验 将A～F 6 组试件分别用1 ml菌悬液浸泡， 37 ℃恒温箱中培养48 h。 取出试件，在灭菌蒸馏水中荡洗以去除表面未黏附的细菌。再将试件分别放入1 ml无菌1640液体培养基中，置于快速混匀器上振荡1 min,比浊仪比浊，记录数据。

1.3.5 抗黏附性长效性实验 选取30 片灭菌试件，随机分成G～K 5 组。G～J组用5%有机硅季铵盐浸泡120 min(抗黏附性实验得出的最佳处理组合)后， 在120 ℃恒温干燥箱中固化60 min成膜，K组用灭菌蒸馏水浸泡后干燥。将G～J试件进行冷热循环实验，在5 ℃和55 ℃的恒温水浴中各浸泡30 s， 此为1 次循环，分别进行0、 2 500、 5 000、 10 000 次循环，K组用蒸馏水浸泡处理。5 组实验所用时间不同，保证实验同时结束。然后将各组试件放入1 ml菌悬液中，37 ℃恒温培养48 h， 取出试件， 冲洗后加入1 ml无菌1640液体培养基，置于快速混匀器上振荡1 min,比浊仪比浊，记录数据。

1.4 统计分析

采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计学分析。抗黏附性实验采用析因设计的方差分析方法，两两组间比较采用S-N-K检验；抗黏附性长效性实验对照组与实验组间比较采用Dunnett-t法，各实验组间比较采用S-N-K检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 抗黏附性实验

对A～F组数据进行分析结果见表1。 对不同处理浓度采用S-N-K检验比较结果见表2。 由浓度和时间组合的浊度均值轮廓图(图1)显示：当处理浓度为5%，浸泡时间为120 min时，浊度值最低，为最佳组合。

2.2 抗黏附性长效性实验

对G～K组数据进行正态性和方差齐性检验，服从正态分布，方差齐(P>0.1)， 使用Dunnett-t检验和S-N-K检验分析(表3～4)， 除了G组和H组之间无差异外，其余任意2 组之间均有差异(P<0.05)。由此可见，冷热循环次数对钴铬合金表面抗黏附性有影响， 由冷热循环次数浊度均值轮廓图(图2)可见，随着冷热循环次数增加，钴铬合金表面抗黏附性有所减弱。但是，冷热循环10 000 次后，钴铬合金表面仍具有抗黏附性。

表1 析因设计方差分析

表2 不同浓度S-N-K检验 (n=24)

图1 浓度和时间组合的浊度均值轮廓图

(I)循环次数(次)(J)循环次数 (I～J)Sig.0对照组-0.4530.0002 500对照组-0.4200.0005 000对照组-0.3150.00010 000对照组-0.2380.000

表4 不同循环次数S-N-K检验 (n=6)

图2 冷热循环次数浊度均值轮廓图

3 讨 论

由于患者佩戴义齿后，可摘义齿基托与黏膜之间形成了新的滞留区，滞留区内唾液流速减慢，流量减少，导致可摘义齿基托组织面菌斑数增多，菌斑及其产物是造成义齿性口炎的主要因素[2]。白色念珠菌是义齿性口炎的主要致病菌，Fenlon等[3]通过采集标本培养发现，炎症越明显者，义齿组织面的白色念珠菌阳性率越高，证明了义齿性口炎的发生与白色念珠菌感染密切相关。

季铵盐是一种阳离子表面活性剂，由烃基取代铵离子中4 个氢原子而生成的化合物，李佳等[4]通过实验证明经过季铵盐类溶液苯扎氯铵浸泡处理的纯钛具有抗菌性。而有机硅季铵盐是一种新型的季铵盐抗菌剂，是将硅氧烷引入季铵盐结构中而制得。其经过水解产生硅醇基(Si-OH)与金属(Me)结合形成一层Me-O-Si-致密的保护膜的同时，硅醇基之间脱水缩合又生成硅氧硅键(Si-O-Si)，从而极大的提高金属的表面性能。不仅如此，有机硅季铵盐以有机硅为媒介，使具有杀菌性能的铵阳离子基团吸附于细菌表面，穿透细胞壁，改变细胞壁的通透性，使细胞内物质如DNA、RNA等泄漏，导致菌体死亡[5-6]，即发生“接触死亡”。Nikawa等[7]利用有机硅季铵盐浸泡纯钛，研究证实其通过Ti-O-Si共价键定植在金属表面，抑制了白色念珠菌和变形链球菌附着和生长，而且通过细胞毒性测试，证明其无明显细胞毒性。这也为本实验利用有机硅季铵盐浸泡处理钴铬合金提供依据。

口腔内的温度会随着进食，喝水，甚至呼吸而发生变化。冷热循环实验则是通过在体外模拟口腔中的温度变化，加速材料老化的实验。根据国际标准组织ISO/TS11405: 2015阐述，要求进行500 次循环。然而有学者[8]统计1998～2013 年193 个相关实验中，只有23 个实验严格按照ISO的标准，其余大多数实验的循环次数各不相同。 Stewardson等[9]认为500 次循环仅相当于口内不足2 个月的时间。而Gale等[10]假设每天发生20～50 次的冷热循环， 10 000 次冷热循环大约相当于临床使用一年的时间。这一观点被许多学者所接受。本实验进行冷热循环发现，经过10 000 次冷热循环后钴铬合金表面硅烷膜仍具有抗黏附性。因此认为，钴铬合金经过有机硅季铵盐浸泡处理后，其表面硅烷膜的抗黏附性可以保持1 年时间。

口腔内的微生态环境非常复杂，实验无法完全模拟口腔内环境和患者日常使用情况。所以，义齿在佩戴使用过程中唾液的冲刷作用、食物的摩擦和机械性清洁等对钴铬合金表面硅烷膜抗黏附性能的影响有待进一步研究。虽然，体外研究不能完全模拟临床使用情况，但是本实验的数据仍然可以为临床使用有机硅季铵盐提高钴铬合金表面的抗黏附性提供参考。

4 结 论

本实验条件下钴铬合金经过有机硅季铵盐浸泡处理后，对白色念珠菌具有长效抗黏附作用。