陕西茯砖茶中优势Eurotium属孢子形态学分析及其分子鉴定

吕嘉枥， 雷 晟， 孟雁南

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

茯砖茶属于中国的传统发酵黑茶，是以黑毛茶为原料，经过汽蒸、渥堆、发花、干燥、包装等一系列复杂工艺精制而成，其中发花是最为关键的工艺[1].其关键技术是微生物以茶叶为培养基的固态发酵过程，通过提供一定的温度和湿度环境，促进有益微生物——“金花菌”的生长繁殖，以在茯砖茶中产生大量的肉眼可见的金黄色颗粒，俗称“金花菌”.该菌群是茯砖茶发酵的优势菌群，对促进茯砖茶品质的形成和功能性具有极其重要的作用[2].近年来对于茯砖茶中微生物的研究，一方面主要集中在成品茯砖茶优势微生物的分离鉴定方面；另一方面则是茯砖茶在发花过程中微生物的研究.研究发现茯砖茶“发花”工艺及其品质形成是由多种微生物共同参与发酵的[3]，有茶叶表面存在的微生物，也有后期在加工过程中自然生长的，而“金花菌”是茯砖茶中的优势菌群.资料已记载的种群有Eurotiumamstelodami、Eurotiumchevalieri、Eurotiumrepens、Eurotiumcostiforme、Eurotiumrubrum、Eurotiumherbariorum、Eurotiumcristatum、Eurotiuminetrmeidum等[4-15].随着分子生物学的发展，新的鉴定技术在食品微生物菌群组成方面的研究发挥着重要的作用[16-20].为了阐明起源于陕西泾阳的茯砖茶中优势菌群Eurotium属的种群关系，本文选取从陕西茯茶产区采集的10种不同品牌茶样品中分离纯化的7株优势Eurotium属的金花菌群，通过光学显微镜和扫描电子显微镜对其孢子进行形态学分析，并与18S rDNA序列分析结合，确定其种属关系，为Eurotium属的菌群鉴定提供参考，同时为陕西茯砖茶中不同地域标志性优势菌群的鉴定提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

试验菌株由陕西科技大学食品与生物工程学院微生物室提供，该菌株是从陕西茯茶产区采集的10种不同品牌茶样品中分离纯化的7株优势金花菌群，经ITS序列鉴定均为Eurotium属，编号分别为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7.

1.1.2 主要培养基成分

(1)察氏培养基(CZ)：蔗糖40 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01g，琼脂20 g，水1 000 mL.

(2)40%蔗糖察氏培养基(CZ40)：蔗糖400 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01g，琼脂20 g，水1 000 mL.

(3)改良察氏培养基(CZG)：蔗糖40 g，硝酸铵3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸馏水1 000 mL,pH 6.8±0.2,121 ℃灭菌15 min.

(4)20%蔗糖改良察氏培养基(CZG20)：蔗糖200 g，硝酸铵3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸馏水1 000 mL.

(5)40%蔗糖改良察氏培养基(CZG40)：蔗糖400 g，硝酸铵3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 50 g，蒸馏水1 000 mL.

(6)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水1 000 mL.其做法是先将马铃薯洗净去皮后称取200 g，切成小块，加水煮烂(煮沸约20～30 min)，用八层纱布过滤，加热，再添加15～20 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1 000 mL，pH自然，分装、加塞、包扎、灭菌，备用.

以上培养基灭菌条件均为 121 ℃、15 min.

1.1.3 试剂药品

DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒：北京擎科新业生物技术有限公司；

18SrDNA通用引物：北京奥维森基因科技有限公司；

NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；

NS4：5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′；

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒：AXYGEN公司；

2×Taq PCR MasterMix(含绿染料)：Biomed.

其他生化试剂均为国产分析纯.

1.1.4 仪器与设备

扫描电镜(PHENOM-PRO，上海飞纳科学仪器有限公司)；离子溅射仪(SBC-12型，北京中科科仪股份有限公司)；测序仪(3730XL， Applied Biosystems)；PCR仪(2720 thermal cycler型，Applied Biosystems)；板式离心机(5810R型，Eppendorf)；凝胶成像装置(JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司)；电泳仪(JY300C Power Supply，北京君意东方电泳设备有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 7株菌产孢构造的显微观察

(1)光学显微镜观察：将7株菌分别以插片法接种于CZ、CZ40、CZG、CZG20、CZG40、PDA培养基中，28℃培养7天后，将盖玻片的一面用无菌棉球擦拭干净，另一面滴入石碳酸棉兰染色液，观察菌株的有性和无性产孢构造特征.

(2)扫描电镜观察：分别取少许7株的菌体，置于2.5%戊二醛溶液中固定2 h以上；磷酸缓冲液清洗3次(20 min/次)；置于饿酸中固定2 h；磷酸缓冲液清洗3次(20 min/次)；用乙醇(浓度依次为30%、50%、70%、80%、90%、100%)洗脱三次(20 min/次)；置于真空冷冻干燥机中干燥、喷金，扫描电子显微镜观察菌体的闭囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子、分生孢子头、分生孢子梗等有性和无性产孢构造特征.

1.2.2 7株菌的18S rDNA序列测定

(1)基因扩增及测序：采用通用引物NS1和NS4扩增E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7的18s rDNA区基因序列，同时以dH2O做负对照.扩增条件为94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min后得PCR产物，扩增成功的PCR产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，并进行测序.

(2)序列比对及系统发育树构建：测序结果提交GenBank数据库并通过Blast检索，获得与目的基因片段同源性最高的18S rDNA基因序列，用MEGA 5.0构建系统发育树，以自展法(Bootstrap)进行检验，重复1 000次.

2 结果与讨论

2.1 7株菌的有性孢子形态学分析

通过7株菌的有性孢子形态学的扫描电镜观察结果表明，7株菌的有性孢子均为子囊孢子，子囊果为闭囊壳，闭囊壳内有大量子囊，每个子囊内有8个子囊孢子，但7株菌的产孢构造有所不同，如下述和图1所示.

E1闭囊壳结构由絮状菌丝所包围，球形，100～170μm，子囊近球形，7～12μm，子囊内含8个子囊孢子，子囊孢子呈双凸镜形，2.8～4.4μm×4～5μm，凸面较为平整，具少量小疣，赤道沟宽浅且明显，宽约为1.2μm，边缘整齐卷曲，子囊孢子外周和赤道脊部位有排列整齐的小孔.

E2子囊果球形或近球形，黄色，处于具饰菌丝网中，70～200μm，内部包裹着具拟薄壁组织的子囊，球形至近球形，6～10μm，子囊内含8个子囊孢子，子囊孢子双凸镜形，凸面粗糙具小疣，孢子大小4～5μm×5～6μm，具两个明显的纵向鸡冠状突起，宽约0.8～1μm，边缘不整，较为卷曲.

E3闭囊壳为球形或近球形，100～180μm(240μm)，子囊球形，9～11μm，子囊孢子双凸镜形，有明显的纵向鸡冠状突起，孢子大小4～5μm×5～6μm，凸面粗糙，具尖疣，赤道沟明显，较浅，边缘稍卷曲，宽约0.6μm.

E4闭囊壳球形，85～160μm，子囊近球形，9～11μm，子囊孢子呈两瓣状，4～5.2μm×4.5～5.6μm，赤道部分具两个明显的、有时稍弯曲的鸡冠状突起，孢子呈凸透镜状，凸面粗糙具小疣，赤道沟约0.6μm，附近有排列整齐的小孔.

E5闭囊壳球形或近球形，直径80～201μm，裸露，黄色，子囊近球形，7～9μm，子囊孢子呈双凸镜形，3.5～4.5μm×4～5μm，孢子两瓣中间具沟，宽约1.2μm，边缘较为整齐卷曲，凸面较为粗糙，边缘和赤道沟内部具有排列整齐的小孔.

E6闭囊壳球形或近球形，100～150μm，闭囊壳裸露，子囊球形或近球形，7～10μm，内部包裹着8个子囊孢子，子囊孢子双凸镜形，4.5～5μm×5～6μm，有两个明显的“赤道”冠，宽约0.6μm，边缘不整，凸面有不规则网结状的肋状突起.

E7闭囊壳由菌丝缠绕形成，为球形或近球形，100～180μm，黄色，子囊球形，或近球形，8～11μm，子囊孢子双凸镜形，5～5.8μm×5.3～6.4μm，具两个明显的赤道冠，宽约0.6μm，凸面粗糙具小疣.

(a)、(b)、(c) 分别为扫描电子显微镜下的子囊果、子囊果释放子囊孢子、子囊孢子图1 E1～E7菌株的有性产孢构造

2.2 7株菌的无性孢子形态学分析

通过7株菌的无性产孢构造的光学显微镜和扫描电镜观察结果表明，无性孢子为分生孢子，分生孢子头为层状放射状结构，7株菌的产孢构造不尽相同，分述如下.

E1分生孢子梗壁光滑，梗直径约7.2～11×80～150μm，分生孢子头拖把型，顶囊为烧瓶形或球形，20～40μm，顶囊次生梗单层，瓶状梗，2.2～3.6×2.5～7μm，从瓶梗处串生出分生孢子，分生孢子椭圆形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙,如图2所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图2 E1菌株的无性产孢构造

E2分生孢子梗壁光滑，5～9×125～225μm，分生孢子头灰绿色，幼时球形，老熟后疏松放射型，顶囊烧瓶形或球形，12～25μm，顶囊次生梗单层，瓶梗2.2～3.2×5～6.4μm，分生孢子由瓶梗处串生，分生孢子椭圆形或腰鼓型，4～4.8×3.2～4μm，壁粗糙，如图3所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图3 E2菌株的无性产孢构造

E3分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子头初为球形，后呈疏松放射型，顶囊烧瓶形或球形，20～40μm，顶囊次生梗单层，瓶梗2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗处分生出，分生孢子椭圆形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙，如图4所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图4 E3菌株的无性产孢构造

E4分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子头初为球形，后为疏松放射形，顶囊烧瓶形或球形，20～40μm，顶囊次生梗单层，瓶梗2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗处分生出，分生孢子椭圆形或腰鼓型，2.4～3.5×2.9～4μm，壁粗糙，如图5所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子.图5 E4菌株的无性产孢构造

E5无性产孢形态与E1基本相同，分生孢子梗壁光滑，2.5～11μm；分生孢子头初为球形，后呈辐射型或疏松短柱型，顶囊烧瓶形，13～35μm，分生孢子为圆球形，壁具小刺，30～90μm，顶囊次生梗单层，瓶梗1.5～2.5×2.5～4μm，分生孢子为圆球形，近球形，2.5～4μm，壁粗糙具小刺，如图6所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图6 E5菌株的无性产孢构造

E6分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子头辐射型，顶囊烧瓶形或球形，20～30μm，顶囊次生梗单层，瓶梗6.5～8.0×3.0～4.0μm，分生孢子由瓶梗处分生出，分生孢子椭圆形或腰鼓型，3.5～6.0×2.9～4μm，壁粗糙具瘤状突起，如图7所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图7 E6菌株的无性产孢构造

E7分生孢子梗壁光滑，7.2～11×80～150μm，分生孢子头疏松放射型，顶囊稍膨大或烧瓶形，20～40μm，顶囊次生梗单层，2.2～3.6×2.5～7μm，分生孢子由瓶梗处分生出，分生孢子椭圆形或腰鼓型，2.0～2.5×2.5～3μm，壁粗糙，如图8所示.

(a)光镜下的分生孢子头 (b)电镜下的分生孢子头 (c)电镜下的分生孢子图8 E7菌株的无性产孢构造

通过光学显微镜和扫描电子显微镜对7株菌的有性和无性孢子形态学观察与分析，并与相关鉴定手册和文献[21-23]中的描述进行对比，结果表明7株菌的种群关系分别为Eurotium属的Eurotiumchevalieri(谢瓦散囊菌，E1)、Eurotiumcristatum(冠突散囊菌，E2、E3、E4、E7)、Eurotiumamstelodami(阿姆斯特丹散囊菌，E5)、Eurotiumcostiforme(肋散囊菌，E6).

2.3 7株菌的18S rDNA序列分析

在7株菌孢子形态学观察与分析的基础上，从分子核酸水平对其差异进行进一步分析研究.选取18S rDNA区域进行试验，对目的条带进行扩增，扩增结果如图9所示.结果显示7株菌中E1的18 s大小约为1 000 bp，E2 到E7 约为1 500 bp.

图9 E1～E 7菌株的18S rDNA PCR 产物电泳图

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如下所示.通过MEGA系统Align selected block by clustalW分析发现，E1、E3、E4、E5、E6、E7序列除了首尾序列存在差异之外，其余序列与E4序列一致.其中E2序列与其他6株菌的序列差别较大，E5、E6、E7序列一致.将其基因序列输入NCBI数据库中进行Nucleotide blast比对及同源性搜索，结果见表1.E1序列长度(Query Length)972 bp，E2序列长度为1629 bp，E3序列长度961 bp，E4序列长度944 bp，E5、E6、E7序列长度均为969 bp.虽然7株菌的序列不完全相同，但均与表1中所列的多种菌有超过99%的相似性.因此，7株菌鉴定结果应为Aspergillusglaucus、Eurotiumherbariorum、Aspergilluspseudoglaucus、Aspergilluscristatus、Eurotiumchevalieri、Eurotiumamstelodami、Eurotiumrubrum、Aspergillusamstelodami其中之一.依据最新国际命名法规[24]，散囊菌属和曲霉属曲霉组是1个单系的类群，7株菌也可为Eurotium或Aspergillus，在这种情况下，应依据形态学鉴定结果.应用MEGA5软件中Phylogeny程序，绘制系统发育树，结果如图10所示.

表1 7株菌的18S rDNA序列比对结果

图10 基于18S rDNA序列构建 的NJ系统发育树

3 结论

茯砖茶中的优势“金花菌”是评价其产品质量优劣的重要指标，也是茯茶地理品牌标志的重要特征.因此，对其中种群及其特性的分析与研究具有重要的理论意义及实用价值.茯砖茶中的优势“金花菌”为Eurotium属的不同菌群，这些菌群在不同茯砖茶品质形成中起着重要作用.

本文通过对来自陕西茯茶产区的10种不同品牌茶样品中分离纯化的7株Eurotium属的优势金花菌的有性和无性孢子的形态学分析，结合分子生物学的18S rRNA序列分析，并与手册和文献[21-23]中的描述与检索表对照分析，以及最新国际命名法规[24]，7株菌的种群关系分别为Eurotium属的Eurotiumchevalieri(E1)、Eurotiumcristatum(E2、E3、E4、E7)、Eurotiumamstelodami(E5)、Eurotiumcostiforme(E6).7株菌同属于散囊菌属或曲霉属.

目前，相关霉菌种属关系鉴定方面的研究除了形态学、分子生物学中的ITS、18SrRNA等以外，还有对NRPS、MLST等[25,26]的差异分析，也有研究者[9,27,28]利用转录组水平的多基因系统发育，分析菌株的种属关系，但这些研究目前均有一定偏差.因此，Eurotium属种群关系的鉴定尚需进一步研究.