BM P4蛋白在食管癌组织中的表达及对其预后的影响

彭伯坚 ，卢秀珊，陈杏苑，张险峰

（1.广东省广州市花都区人民医院消化内科，广东 广州 510800；2.暨南大学第一临床学院）

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，临床早期常无明显表现，以进行性吞咽困难为典型症状，大多数患者发现时已为晚期，多已发生转移，对疾病治疗和患者预后造成较大影响［1-2］。我国每年大约有15万人因食管癌而死亡，其发病与化学性因素、生物学因素及遗传因素等多种因素相关，目前临床治疗食管癌的主要方式为手术治疗和放化疗［3］。尽管食管癌的诊断和治疗技术都在不断发展，但食管癌的早期诊断率仍较低，预后亦较差，数据表明其5年生存率仅为15%～30%［4-5］。因此寻找可预测食管癌转移和预后的分子标志物成为研究的中心，有研究发现骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及其通路中下游蛋白Smad1和p-Smad1在食管癌的发生和转移中有着重要作用［6-7］。本研究拟探讨BMP4、Smad1和p-Smad1蛋白在食管癌组织中的表达及对其预后的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2010年1月至2013年1月于广州市花都区人民医院住院进行治疗的50例食管癌患者手术切除的食管癌组织及相对应食管癌周边非癌食管组织。纳入标准：（1）所有患者均进行组织病理学检查符合相应诊断标准；（2）入院前均未诊断恶性肿瘤性疾病；（3）无化疗和放疗史。排除标准：（1）伴有其他类型或其他器官肿瘤者；（2）伴有其他严重心、肝、肾或神经系统疾病者；（3）对所用药物过敏者；（4）处于妊娠或哺乳期患者；（5）患者或家属不愿配合治疗者。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。50例患者中男25例，女25例，年龄55～78岁，平均年龄（65.9±2.4）岁；临床分期：（Ⅰ+Ⅱ）32例，（Ⅲ＋Ⅳ）18例；淋巴结转移15例。

1.2 免疫组织化学方法 对50例食管癌组织、非癌食管组织的新鲜标本进行石蜡包埋，切片染色，采用免疫组化方法检测BMP4、Smad1与p-Smadl蛋白的表达。研究所用相应兔抗人多克隆抗体均购于美国Abcam公司，二抗及DAB试剂盒来源于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 观察指标 测定食管癌组织及非癌食管组织标本中BMP4、Smad1及p-Smad1蛋白的表达量；分析食管癌组织中BMP4蛋白与Samd1及p-Samd1蛋白表达量的相关性；分析BMP4、Samd1及p-Samd1蛋白表达量与食管癌预后的关系。结果判读：阅片采用双盲法由2名经验丰富的病理科医师进行，每张切片随机选5个高倍视野，每个视野计数100个细胞进行观察评判。细胞核或细胞质内出现棕黄色颗粒的细胞视为BMP4、Samd1及p-Samd1阳性细胞。积分规则为：阳性细胞数占总细胞数0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，75%以上为4分；其中，≤2分为低表达，＞2分为高表达。

1.4 随访 对所有患者进行门诊及电话等方式的随访，时间最少为5年，最近的为2018年1月，以疾病确诊当天起算。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料采用［n（%）］表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差表示，采用t检验。采用Spearman秩相关对不同蛋白表达量之间进行相关性分析；采用Log-rank检验分析生存曲线的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMP4、Samd1及 p-Samd1蛋白在不同组织中的表达量比较 食管癌组织中BMP4、Samd1及p-Samd1蛋白表达量显著高于非癌食管组织，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 BMP4、Samd1及p-Samd1蛋白在不同组织中的表达量比较

2.2 食管癌组织中BMP4蛋白与Samd1及p-Samd1蛋白表达的相关性 Spearman秩相关分析结果显示，食管癌组织中BMP4蛋白与Samd1蛋 白 表 达 无 相 关 性（r=0.011，P＞0.05）；与 p-Samd1蛋白表达呈正相关（r=0.491，P＜0.01）。

2.3 BMP4、Samd1及 p-Samd1蛋白表达量与食管癌预后的关系 食管癌患者的5年生存率为48.00%（24∕50）。经 Log-rank 检验 分别比较BMP4、Samd1及p-Samd1蛋白高表达组与低表达组的生存曲线，显示BMP4及p-Samd1蛋白的高表达是食管癌患者预后不良的因素（P＜0.05），而Samd1蛋白的表达量与食管癌患者预后结局关系不大（P＞0.05）。见表2。

表2 BMP4、Samd1及p-Samd1蛋白表达量与食管癌预后的关系

3 讨论

食管癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其致死率在全球范围内居恶性肿瘤的第6位［8］。我国属食管癌的高发地区，GLOBOCAN的统计数据显示2018年全球新发食管癌病例有572 034例，患者死于食管癌人数有508 585例。食管癌的致死率接近其发病率，这与抗肿瘤药物治疗的失败密切相关［8-9］。手术切除是食管癌主要的治疗方法，但是术后食管癌局部复发和远处转移是临床上面对的难题。食管癌转移是一个复杂且有多步骤参与的过程。其中，肿瘤细胞从原发部位游离是转移最初始步骤，也是转移发生的先决条件［10］。因此，如果能阻止这一过程的发生，将有可能从源头上控制肿瘤的转移。食管癌是一种上皮源性的肿瘤，细胞之间存在着广泛的紧密连接［11］。众多分子，如E-钙粘蛋白等在维持上皮性肿瘤特性以及细胞间连接中发挥着十分重要的作用［11］。肿瘤细胞如何打破这种连接方式，从原发部位游离出来，从而启动肿瘤的侵袭转移，其机制尚不清楚。

TGF-β超家族的成员骨形态发生蛋白BMP4是一类主要在脊椎动物的发育中起关键作用的蛋白，包括细胞分化、迁移、增殖与凋亡等。近年来学者们研究亦发现BMP4可诱导某些上皮细胞源性肿瘤细胞发生从而促进其转移，如卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌等。其主要通过以下通路发挥其作用：BMP4与细胞表面的受体结合，活化并激活下游信号分子，使Smad1∕5∕8磷酸化，活化的Smad1∕5∕8与Smad4结合形成复合体并转移至细胞核内，调控相关转录因子从而对机体进行功能调节［12-13］。

本研究探讨了BMP4在食管癌中的表达及其对患者预后的影响和相关机制分析，结果显示，BMP4及其下游蛋白Smad1和p-Smad1在食管癌组织中的表达量均显著高于非癌食管组织（P＜0.05），表明BMP4在食管癌的发生发展中可能有重要意义，且可能通过Smad1和p-Smad1通路发挥作用。同时研究发现，食管癌组织中BMP4与p-Samd1蛋白表达呈正相关（r=0.491，P＜0.01）；通过进一步对食管癌患者预后进行分析发现，BMP4及p-Samd1的高表达是食管癌患者预后不良的因素（P＜0.05），而Samd1的表达量与食管癌患者预后结局关系不大（P＞0.05）。这些结果提示BMP4与Smadl的磷酸化产物p-Smad1与食管癌的预后的关系密切，检测BMP4、Smadl与p-Smadl的表达可更为有效地预测食管癌的发生及预后，但其具体细致的信号传导通路如何则有待进一步研究阐明。