气相色谱-串联质谱法测定大米中非法添加的石蜡

徐 芬，江 丰*，李诗瑶，程 慧，安 迪

（湖北省食品质量安全监督检验研究院 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075）

石蜡分食品级和工业级，其中食品级石蜡只能在国家标准规定的使用范围内限量使用[1]，其广泛应用于食品包装、水果涂层等或作为被膜剂、脱模剂、消泡剂限量使用在各种食品加工工艺中；工业级石蜡属于非食用物质，且含有重金属、多环芳烃、硫化物等[2-3]，长期食用会严重影响人体的消化系统和免疫功能，对人们的身体健康十分不利。近年来，不法分子为了改善大米的感官特性，使其外观更有光泽，用石蜡对大米进行抛光，以掩盖陈米原本灰暗霉变的色泽，而且抛光会损失陈米表层的微量元素和维生素，影响人体对营养素的吸收，从而影响人体的健康。因此有必要对大米中石蜡的检测方法进行深入研究，建立准确、可靠的检测方法，为大米质量安全监管提供参考，以保护广大消费者的切身利益。

目前，已颁布的国家标准GB/T 21309—2007《涂渍油脂或石蜡大米检验》[4]，只能对大米中的石蜡进行简单的定性分析，并不能定量。有文献报道，可以采用物理法[5-6]、傅里叶红外光谱法[7-9]、液相色谱法[9-11]、气相色谱法[12-15]、气相色谱质谱法[14-20]等对石蜡进行检测。其中，物理法方法简单，但灵敏度较低，不能定量；傅里叶红外光谱法在前期需要大量样品建立光谱库；已有许多研究表明，高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法灵敏度高、选择性好，可应用于食品非法添加石蜡的检测中，但各个方法中使用的标准溶液、前处理方法、以及定性定量方法各不相同，且尚未完全解决食品中石蜡准确定量的问题。本研究根据大米基质的特性和石蜡的物理性质，首次采用排除法，选用C24、C26、C28、C30、C33这5种烷烃进行石蜡的定性与定量分析，建立了一种气相色谱-串联质谱（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法，以期能快速、准确检测大米中石蜡。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：市售；正己烷（色谱纯）：Fisher公司；石油醚（分析纯）、硫酸（分析纯）、8种切片石蜡（熔点分别为48～50℃、50～52℃、52～54℃、54～56℃、56～58 ℃、58～60℃、60～62℃、62～64℃）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME2002E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SB25-12DTS超声波双频清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；HEI-VAP/LR20旋转蒸发仪：德国Heidolph GmbH公司；MS3basic涡旋仪：IKA；5810R离心机：德国Eppendorf公司；7890B-7000D串联三重四级杆气相色谱质谱仪：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

石蜡标准储备液：准确称取切片石蜡0.1000g于100mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，此溶液质量浓度为1.0 g/L。

石蜡标准使用液：准确吸取1.00 mL石蜡标准储备液于10 mL容量瓶，用正己烷定容至刻度，此溶液质量浓度为0.10 g/L。

1.3.2 试样前处理

称取20 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL石油醚，超声浸提30 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于梨形旋蒸瓶中；再加入20 mL石油醚到提取瓶中，再超声重复提取一次，离心，合并提取液。将提取液于旋转蒸发仪上浓缩近干，加入5.0 mL正己烷溶解，再加入0.5 mL硫酸溶液，涡旋振荡1 min，4 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液过0.45 μm微孔滤膜后，待测。

1.3.3 仪器条件

HP-5MS毛细管色谱柱（0.25μm×0.25mm×30m）；升温程序：150℃保持1min，以10℃/min升温至300℃，保持10min，以10℃/min升温至310℃，保持10 min；载气：氦气，流速：1 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：无分流进样；进样口温度：280 ℃；离子源类型：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度：250℃；GC-MS接口温度：280℃。

2 结果与分析

2.1 石蜡的定性分析

根据熔点不同，熔点范围在48～64℃的固体切片石蜡有8种不同的型号，但每种型号的主要组分均为正构烷烃CnH2n+2的混合物。将质量浓度为0.10 g/L的8种石蜡标准使用液分别用气相色谱-串联质谱仪进行一级质谱全扫，通过结果分析，8种石蜡都含有C22～C33烷烃组分。由于8种石蜡标样的C22～C33烷烃组分在色谱图上均有响应，只是峰面积的大小不同，故在定性和定量分析实验中，只需选择一个中间熔点的石蜡作为标准品。本方法选取54～56℃熔点的石蜡配制标准溶液，优化色谱和质谱条件，建立GC-MS/MS方法，C22～C33烷烃组分在色谱图上的响应如图1所示。

分别对67批次大米样品进行分析，色谱图上C22～C33处均有响应的样品为0批次，即67批次大米均为阴性样品。通过筛选发现，67批次大米样品在色谱图上C22～C33处的响应各不相同，但是在C24、C26、C28、C30、C33处定性和定量离子对均没有干扰峰，则可以排除C22、C23、C25、C27、C29、C31、C32，最终选择C24、C26、C28、C30、C33作为大米中石蜡的定性烷烃。因此在相同试验条件下进行样品测定时，若色谱图中C24、C26、C28、C30、C33处两对离子都有出峰，则可判定大米样品中含有非法添加的石蜡。

图1 石蜡的SRM图（C22～C33）Fig.1 SRM diagram of paraffin(C22-C33)

2.2 石蜡的定量分析

用选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）模式对标准物质进行分析时，每种烷烃选择两对离子进行监测，其中85.1→57这对离子由于灵敏度高，可以作为定量离子，C22～C33烷烃的保留时间及定量、定性离子对见表1。对定量离子进行积分，不同熔点的石蜡的峰面积如表2所示。计算峰面积之和，通过不同物质峰面积加和的最小相对标准偏差的方法来挑选加和的峰，结果见表3。从表3可以看出，C24+C26+C28+C30+C33加和的峰面积相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）为8.73%，可以满足大米中石蜡的定量分析。

表1 C22～C33烷烃的保留时间及定量、定性离子对Table1 Retention time and quantitative and qualitative ion pairs of C22-C33alkanes

续表

表2 不同熔点石蜡的C24、C26、C28、C30、C33烷烃的峰面积Table2 Peak area of C24,C26,C28,C30and C33alkline of paraffins with different melting points

表3 不同烷烃峰面积加和及其相对标准偏差Table3 Relative standard deviation and peak areas summation of different alkanes

2.3 前处理条件的优化

石蜡溶于石油醚、二甲苯、乙醚、苯、三氯甲烷、四氯化碳等非极性溶剂，不溶于水、甲醇等极性溶剂，考虑到试剂的安全性，该方法选择石油醚作为提取溶剂。由于在提取时，石油醚同时也把样品中的脂肪提取出来，上机前需去除杂质。浓硫酸不与石蜡发生反应，但是能氧化提取液中的脂肪，使石蜡与脂肪分离。在提取液中加入浓硫酸，离心分层后可以直接吸取有机层上机。已有文献表明，从操作步骤和回收率等方面综合比较，超声提取明显优于索氏提取和加热回流提取[14]，因此本方法采用超声提取方式。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围

精密量取石蜡标准使用液适量，用正己烷制成质量浓度分别为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.06 mg/L、0.08mg/L的系列混合对照品溶液，在上述参数条件下，以标准溶液相应的质量浓度（x）为横坐标，C24+C26+C28+C30+C33峰面积之和（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为y=1130.72x-10 145.56，相关系数R2=0.998 0，结果表明，石蜡质量浓度在0.01～0.08mg/L范围内线性关系良好。以3倍信噪比测得该方法的检出限为0.25mg/kg，以10倍信噪比测得该方法的定量限为0.75 mg/kg。

2.4.2 方法的回收率与精密度

在空白大米样品中加入2.50 mg/kg、5.00 mg/kg、10.00 mg/kg 3个不同浓度的石蜡标准溶液，按照1.3的方法进行提取分析，平行测定3次，结果见表4。大米基质SRM图和加标样品图（加标量10.00mg/kg）分别如图2、图3所示。

表4 加标回收率、精密度实验结果Table4 Results of standard recovery rate and precision experiments

图2 大米基质的SRM图Fig.2 SRM diagram of rice matrix

图3 大米的加标样品的SRM图Fig.3 SRM diagram of adding standard sample of rice

由表4可知，加标回收实验的平均回收率分别为99.54%、93.38%、110.22%，相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）分别为12.11%、5.42%、8.31%，结果表明，本方法具有良好的准确度和精密度，能够满足日常检测的要求。

3 结论

本研究建立了气相色谱-串联质谱法测定大米中石蜡的方法。在样品的前处理过程中，采用石油醚进行超声提取，加入浓硫酸净化，有效提高了前处理效率，并且在本方法的仪器条件下，石蜡在较短的分析时间内能得到良好的定性和定量结果。方法学实验结果表明，该方法的检出限为0.25 mg/kg，定量限为0.75 mg/kg，加标回收率及精密度实验的平均回收率为93.38%～110.22%，相对标准偏差（RSD）为5.42%～12.11%，相关系数R2为0.9980。方法快速、灵敏、准确，可以满足大米中石蜡的检测需求，为打击大米中非法添加石蜡提供了较准确的检测方法。