遗传性嗜铬细胞瘤家系血浆儿茶酚胺及其代谢物的含量测定

刘洪旭 邓思珊 马丽红 马振菁 王新康

[摘要] 目的 建立高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）法测定遗传性嗜铬细胞瘤家系血浆儿茶酚胺及其代谢产物的含量的方法。 方法 工作电极为玻璃电极，参比电极为Ag-AgCl电极，电压0.6 V，温度30℃。色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;以甲醇为流动相A，0.1%磷酸二氢钠（含EDTA-Na和辛烷磺酸）水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min;柱温为室温;检测波长：280 nm;进样量：20 μL。 结果 正常健康人中肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）、甲氧基肾上腺素（MN）分别为（56.71±25.67）、（98.62±36.90）、（78.36±22.36）、（33.27±14.62） ng/L。嗜铬细胞瘤家系中确诊的2例嗜铬细胞瘤患者的NE分别为353.36、563.87 ng/L和NMN分别为425.71、527.65 ng/L，其余18位家属的相关检测值在正常健康成人的范围内，其他2位家属的相关检测值比正常值高，建议去医院进一步检查。 结论 该方法简便，灵敏、准确，可用于临床嗜铬细胞瘤患者的检测。

[关键词] 高效液相色谱-电化学检测器;嗜铬细胞瘤;儿茶酚胺;代谢

[中图分类号] R586.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0113-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of catecholamines and their metabolites in plasma of hereditary pheochromocytoma families by high performance liquid chromatography-electrochemical detector （HPLC-ECD）. Methods The working electrode was a glass electrode and the reference electrode was an Ag-AgCl electrode with a voltage of 0.6 V and a temperature of 30℃. Using Ultimate XB-C18 （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）; using methanol as mobile phase A， 0.1% sodium dihydrogen phosphate （containing EDTA-Na and octanesulfonic acid） aqueous solution as mobile phase B， gradient elution， flow rate 0.8 mL/min; column temperature was room temperature; detection wavelength was 280 nm; injection volume was 20 μL. Results In normal healthy people， the contents of epinephrine（E）， norepinephrine（NE）， methoxy norepinephrine （NMN）， methoxy-adrenalin （MN） were （56.71±25.67）， （98.62±36.90）， （78.36±22.36）， （33.27±14.62） ng/L. The NEs of 2 patients with pheochromocytoma diagnosed in pheochromocytoma were 353.36， 563.87 ng/L and NMN were 425.71 and 527.65 ng/L， respectively. The correlation detection values of the other 18 family members were within the range of normal healthy adults. The correlation detection values of the other two family members were higher than the normal values. it is recommended to go to the hospital for further examination. Conclusion This method is simple， sensitive and accurate and can be used for the detection of patients with clinical pheochromocytoma.

[Key words] High performance liquid chromatography-electrochemical detector; Pheochromocytoma; Catechol-amine; Metabolize

兒茶酚胺类物质是由肾上腺髓质分泌的一类重要的神经递质，主要包括肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺等，嗜铬细胞瘤患者持续或间断地释放大量儿茶酚胺类物质作用于肾上腺素能受体，引起持续性或阵发性高血压伴头痛、多汗、心悸三联症状，继而会引起多个器官功能及代谢紊乱[1-2]。患者可因长期高血压致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象，危及生命，但如能及时、早期获得诊断和正确治疗，90%的患者可以治愈。因此，检测血液儿茶酚胺对临床诊断嗜铬细胞瘤具有重要意义[3-5]。临床主要采用比色法和放射免疫法检测E和NE，其干扰较多，无法满足生物样品的检测[6]。近年来，分析仪器发展较快，研究人员开发了更灵敏、更特异的高效液相色谱法来检测上述物质，其具有样本用量较少、特异性和灵敏度高的特点，在临床化学检测领域有着较广泛的应用[7～10]。儿茶酚胺代谢产物包括甲氧基去甲肾上腺素（normetanephrine，NMN）和甲氧基肾上腺素（metanephrine，MN），其经单胺氧化酶氧化为香草扁桃酸，最终经肾脏由尿液排泄。血浆游离型代谢物主要来源肿瘤细胞，其与儿茶酚胺长期分泌增加有关，不受肾上腺交感神经兴奋影响[11]，且半衰期相对较长[12]，不易产生波动。通过检测代谢物能够更准确反映嗜铬细胞瘤儿茶酚胺合成的真实情况[13-15]。本研究旨在建立采用高效液相色谱-电化学检测器（HPLC-ECD）法测定一家族性嗜铬细胞瘤家系的血浆E、NE及其代谢产物NMN和MN的含量，为家系嗜铬细胞瘤的诊断和预期提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters液相色谱仪配L-ECD-6A电化学检测器及柱温箱（美国Waters公司）;离心机、电子分析天平（瑞士）、MilliQ纯水系统（Millipore公司）、涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.2 试药

肾上腺素对照品（批号：100154-201104）、去甲肾上腺素对照品（批号：100169-201103）、甲氧基去甲肾上腺素对照品（批号：1-ATH-165-1）、甲氧基肾上腺素对照品（批号：2-MSC-183-6）、内标物4-羟基-3甲氧基胺酸盐（批号：1-LJC-56-1）均为加拿大Toronto research Chemicals公司产品。甲醇（色谱纯，上海星可生化有限公司）。其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1 样本获取

選取2017年4～6月福建省医科院职工和福建省立医院实习学生30名，均为健康成人，男女各15名，年龄20～45岁，血压均在正常范围（收缩压：90～139 mmHg，舒张压：60～89 mmHg，1 mmHg=0.133 kpa）。选取2017年6月中国汉族东南地区1个嗜铬细胞瘤家系，4代共22人，其中确诊2例。本研究经福建省医学科学研究院伦理委员会同意，所有受试者及其家系成员均签署知情同意书，并自愿提供外周血样本。

受试者早晨空腹，休息15 min后使用肝素钠抗凝真空管采集患者静脉血。3500 r/min离心10 min，离心半径为25 cm，分离血浆，于-80℃冻存。

2.2 色谱条件

电化学检测条件：工作电极为玻璃电极，参比电极为Ag-AgCl电极，电压0.6 V，温度30℃。色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸二氢钠（含EDTA-Na和辛烷磺酸）水溶液为流动相B，梯度洗脱;流速：0.8 mL/min;柱温：室温;检测波长：280 nm;进样量：20 μL。洗脱梯度：0～2 min 10%A，2～5 min 10%A→30%A，5～30 min 30%A。

2.3 供试品溶液的制备

取血浆2 mL，加10%偏重亚硫酸0.2 mL，5%EDTA 5 mL，内标物4-羟基-3甲氧基胺酸盐（0.4 mg/mL）50 μL，加5 g酸洗氧化铝，混匀，调pH值8.4～8.5，搅拌10 min，弃去上清液，氧化铝用纯净水洗涤2次，每次10 mL，最后在氧化铝中加入0.04%高氯酸1 mL，搅拌，混合均匀，震荡2 min，吸取上清液，即得。

2.4 对照品溶液制备

精密称取标准品E、NE、NMN和MN适量，置于10 mL容量瓶中，加入0.04%高氯酸溶解并稀释到刻度配置成0.2 mg/mL的对照品储备液，分装后置于-70℃冰箱冻存。内标溶液：精密称取内标物适量，用0.04%高氯酸配制成100 ng/mL的对照品储备液。

2.5 标准曲线的绘制与最低检测限

本研究以正常人血浆为基质绘制标准曲线。将配置好的标准储备液稀释为系列混合标准液，加入到混合血浆中，按照“2.3”项下制备。以待测物峰面积与内标物峰面积之比减去基质中待测物峰面积与内标物峰面积之比为Y，待测浓度为X，权重因子W=1/X，作加权回归分析，绘制标准曲线，以S/N=3确定检测限。结果见表1。

2.6 精密度

取同一份混合对照品，连续进样6次，按“2.2”色谱条件测定，记录各物质的色谱峰峰面积。E、NE、MN和NMN的RSD分别为1.25%、2.05%、0.98%及0.82%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性

按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备的样品，放置0、2、4、8、10 h后，分别精密吸取20 μL，注入色谱仪，按“2.2”色谱条件测定，记录各色谱峰峰面积。E、NE、MN和NMN的RSD分别为1.69%、2.01%、1.15%及1.32%，表明血浆内物质在10 h内稳定性良好。

2.8 重复性

按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备5份样品溶液，按“2.2”色谱条件测定。E、NE、MN和NMN的RSD分别为1.41%、1.58%、1.26%及0.98%（n = 5），表明该方法的重复性良好。

2.9 回收率试验

分别添加E、NE、MN和NMN的高、中、低三种浓度标准品溶液到混合血浆标本中，按“2.3”项下操作，测定加标前后标准物质的浓度，每个浓度平行测定3次。血浆样本4种标准物质的平均回收率为87.6%～116.4%，高、中、低浓度标准物质在血浆中回收率良好。见表2。

2.10 样品测定

取30名健康成人的血浆，按照“2.3”项下操作制备供试品溶液，按“2.2”的色谱条件测定，记录各物质的色谱峰的峰面积。

选取嗜铬细胞瘤家系，4代共22人，其中2人为确诊患者。经色谱方法检测，确诊的2位嗜铬细胞瘤患者的NE分别为353.36、563.87 ng/L，NMN分别为425.71、527.65 ng/L，其余18位家属中检测值在正常健康成人范围，其他2位NE分别为234.54、198.32 ng/L，其NMN分别为198.36、178.65 ng/L，比正常值高，建议去医院进一步检查。

3 讨论

近年来，随着医学诊疗技术的发展，内分泌代谢病的理论与实践水平也有大幅度提高，国内对嗜铬细胞瘤病例的研究和报道也越来越多，对嗜铬细胞瘤病例的临床特征观察趋于细致，治疗手段也更为丰富，对嗜铬细胞瘤的诊断、鉴别诊断和疗效观察无疑会起到有力的推动作用[16-18]。嗜铬细胞瘤是起源于肾上腺髓质嗜铬细胞，以分泌大量儿茶酚胺的罕见肿瘤，可引起阵发性或持续性高血压，继发神经系统的损害[13]。嗜铬细胞瘤引起的高血压性脑出血是神经系统损害的表现之一。经过手术治疗后，大部分患者可以获得较好的预后。嗜铬细胞瘤的细胞大量分泌儿茶酚胺类物质如肾上腺素、去甲肾上腺素及多巴胺。这些物质在儿茶酚胺-O-甲氧基转移酶的作用下生成甲氧基肾上腺素类物质（MNs）[11]。游离型MNs经过肿瘤细胞分泌，慢慢渗漏进入血液循环。因此，嗜铬细胞瘤的诊断应该测定血浆和24 h尿液中儿茶酚胺及其代谢物，包括E、NE、MN和NMN含量。但是，一些药物如对乙酰氨基酚、儿茶酚胺类和左旋多巴等药物可以影响儿茶酚胺类及其代谢物含量检测，需要告知患者避免使用该类药物，或者停用2周后，再检测，避免假阳性[19-21]。

本研究采用HPLC-ECD法，以30名正常健康人的血浆肾上腺素、去甲肾上腺素及代谢物甲氧基去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素的含量测定统计数据为指标，2例确诊为嗜铬细胞瘤患者、18名正常人、确诊的2例嗜铬细胞瘤患者的NE和NMN远高于正常健康患者，其余18名家属中检测值在正常健康成人的范围，其他2名比正常值高，建议去医院进一步检查。本研究对嗜铬细胞瘤诊断、鉴别诊断和预后，有较好的临床意义。

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（收稿日期：2018-06-27  本文编辑：王   蕾）