不同冻存时间对人颗粒脂肪活性影响的实验研究

魏国茜 顾洛莎 伍明政 白洁 顾劲松 于江 闫润虎 张怡

[摘要] 目的 探索不同凍存时间对人颗粒脂肪活力的影响，寻求更为满意的颗粒脂肪冻存时间，为临床自体脂肪移植提供理论依据。 方法 收集2016年6～10月广州广美整形美容医疗门诊部20～40岁行大腿内侧自体脂肪抽吸移植术女性41例的脂肪标本，经生理盐水漂洗2次静置分离后加入相应留存脂肪量等体积的低温冻存保护液于-196℃（液氮）冻存。选择冻存3个月（A组）和6个月（B组）的标本复温，通过苏木精-伊红（HE）及台盼蓝染色观察冻存脂肪细胞形态并计算脂肪细胞存活率，肌酸激酶测定酶活力、免疫组化CD105检测脂肪干细胞（ADSCs）数量，比较A、B两组脂肪细胞活力变化情况。 结果 脂肪细胞计数分析脂肪细胞存活率及肌酸激酶测定结果显示，在相同低温条件下两组脂肪细胞活力差异无统计学意义（P > 0.05）;HE染色显微镜下比较脂肪细胞形态发现，A、B两组脂肪细胞形态基本正常，仅于A组见少数ADSCs。 结论 使用液氮冻存人颗粒脂肪组织安全有效，于-196℃下冻存6个月，甚至更长时间，是较理想的冻存条件。

[关键词] 颗粒脂肪;冷冻保存;储存时间;脂肪细胞活力

[中图分类号] R622.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（c）-0016-04

[Abstract] Objective To explore the effect of different cryopreservation time on human adipose cell vitality， and seek a more satisfactory granular fat cryopreservation time， to provide a theoretical reference for autologous fat transplantation in clinic. Methods The fat granule samples from interior thigh of 41 healthy women （20-40 years old） that underwent conventional liposuction were collected in Guangmei Medical Plastic and Cosmetic Outpatient Department from June to October 2016. All fat granule samples were cryopreserved in liquid nitrogen freezer of -196℃ after washed twice by physiological saline and placed quiescently to isolate them from the physiological saline and then an equal volume of freezing protection liquid was added into the fat granule samples. The samples that had been stored for 3 months （group A） and 6 months （group B） were selected to test the activity of frozen fat after thawed. The morphology and the death cell percentage of cryopreserved granule fat cells was observed and calculated respectively by hematoxylin-eosin （HE） staining and trypan-blue staining. The creatine kinase level was tested to calculate fat cell enzyme vitality. The CD105 on adipose derived stem cells （ADSCs） was detected by immunohistochemical methods to compare the effect of different cryopreservation time on the fat cell activity in vitro. Results Fat cell count analysis on the survival rate of fat cells and the determination of creatine kinase showed no statistically significant differences in the fat cell survival rates between group A and group B under the same cryopreservation temperature （P > 0.05）. The comparative observation of the fat cell morphology by HE staining under the microscope showed that all cell membranes keep well in the two groups. Immunohistochemical staining of CD105 showed that there were only a few of ADSCs in group A. Conclusion Cryopreservation of human granular adipose tissue with liquid nitrogen is safety and effective. The fat cells can be cryopreserved at -196℃ for 6 months or even longer time， and this cryopreserved temperature is ideal.

[Key words] Fat granule; Cryopreservation; Stored time; Fat cell vitality

自体脂肪移植已成为整形美容外科修复、重建的首选材料[1-2]。但其移植后的过度吸收问题尤为普遍，有研究[3-7]表明移植8～12个月后自体移植脂肪体积多减少至移植时体积的30%～60%。因此，临床上常需少量、多次移植才可达到预期效果，但多次手術操作势必会对患者带来过多身心痛苦、手术风险及经济负担。如能就同一患者一次手术抽取额外足量脂肪，体外长期冻存，再次需要时，复温后直接注射，即可避免上述问题。然而，对于脂肪组织取材后冻存方法、温度、时间及冻存后脂肪细胞活力，国内外学者报道不一，目前冻存时间多在3个月左右，超过1年者鲜有报道。相关研究[8-22]结论多倾向于温度越低，冻存效果越好。鉴于自体脂肪移植后再吸收较多出现在术后3～6个月，5个月后方可完全再生[23]，因此临床需要采取重复注射和补救手术的时间往往在此时段。有学者报道深低温冻存大鼠和人脂肪组织3个月和6个月获得了良好效果[16-17，19]。但在此时段冻存人颗粒脂肪组织的研究报道较少，故本研究选取冻存3、6个月人体脂肪组织进行研究，以探索该冻存时间内脂肪细胞的活力，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 临床资料  收集2016年6～10月经广州广美整形美容医疗门诊部行大腿内侧自体脂肪抽吸移植术求美女性的脂肪标本共86例，排除丢失、破损及其他不符合条件者，最终选取41例，年龄20～40岁。纳入标准：①病例经术前血常规、感染五项、血生化及心电图检查无异常，排除传染病、代谢性疾病者。②术前均签署手术知情同意书。③吸脂部位：大腿内侧;④获取方式：2.5 mm直径双孔钝头吸脂针连接10 mL注射器负压下手动吸脂。⑤纯化方式：生理盐水洗涤2次后静置分层;⑥低温冻存保护液：60%小牛血清+25%DMEM高糖培养基+15%DMSO;⑦冻存时间分别达到3个月或6个月。不符合纳入标准者一律排除。本研究经广美整形美容医疗机构医学伦理委员会批准同意。

1.1.2 主要试剂及仪器  国产小牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）、胶原酶Ⅰ（北京索莱宝科技有限公司）、台盼蓝染料（北京索莱宝科技有限公司）、肌酸激酶（CK）测试盒（南京建成生物工程研究所）、多聚甲醛（PFA）（上海生工生物工程股份有限公司）、OCT包埋剂（美国樱花SAKURA冷冻包埋剂）、小鼠SP检测试剂盒（北京中彬金桥生物技术有限公司）、Anti-CD105抗体[MEM-229]（FITC，英国Abcam公司）;正置荧光显微镜（U-RFL-T，日本Olympus公司）、倒置荧光显微镜（IX71，日本Olympus公司）、冰冻切片机（HM525，美国赛默飞世尔科技公司）、酶标仪（美国Bio-Rad公司）、深低温冰箱（美国赛默飞世尔科技公司）、液氮罐（成都金凤液氮容器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 颗粒脂肪组织的获取与纯化处理  术前大腿内侧吸脂区域画线，常规碘伏消毒，铺巾。于吸脂区域边缘2%利多卡因局部浸润麻醉，做一约0.3 cm皮肤切口为进针口，皮下止血钳稍做钝性分离，在吸脂区域皮下脂肪层均匀注射肿胀麻醉液（每500 mL生理盐水中加入2%利多卡因20 mL、肾上腺素0.5 mL），使皮下脂肪肿胀变硬，皮肤外观呈橘皮样改变。待麻醉起效后，10 mL注射器连接2.5 mm直径双孔钝头吸脂针，止血钳固定注射器活塞于10 mL刻度处，吸脂针针孔向下，进行扇形多层次多隧道往复抽吸。获取的颗粒脂肪组织经生理盐水漂洗2次纯化处理，静置后保留第2层纯化的颗粒脂肪组织，一部分用于移植填充，另外每例留取足量颗粒脂肪标本，一式3份，分别按2.5 mL×2和1 mL×1盛入高压灭菌后的5 mL和1.8 mL冻存管中并加入相应留存脂肪量等体积低温冻存保护液（60%小牛血清+25%DMEM高糖培养基+15%DMSO），冻存于-196℃液氮罐。

1.2.2 颗粒脂肪组织的冻存  将与低温冻存保护液混合后的颗粒脂肪组织按照慢冻原则分别冻存。4℃冰箱冷藏室预冷30 min，放入普通冰箱冷冻室4 h，转入-80℃深低温冰箱中冻存24 h后，置于液氮中冻存。

1.2.3 颗粒脂肪组织的分组  从41例标本中将冻存时间达到3个月标本18例命名为A组;冻存时间达到6个月标本23例命名为B组。两组患者年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2.4 颗粒脂肪组织复温  将标本取出后，迅速置于37℃水浴箱中解冻，轻柔晃动至完全融化，立即吸出冻存管中低温保护液，颗粒脂肪以PBS缓冲液洗3遍，洗去残留冻存液后待实验。

1.2.5 台盼蓝染色法脂肪细胞计数  ①台盼蓝母液的配置：称取4 g台盼蓝干粉加入少量双蒸水进行研磨，加入双蒸水至100 mL，配制成4%台盼蓝母液，于4℃冰箱中保存备用。②取颗粒脂肪1 mL加入3 mL 0.1%Ⅰ型胶原酶（组织量∶消化酶=1∶3）置于37℃恒温气浴振荡器中，180 r/min，消化30 min。③等体积生理盐水中和消化液，终止消化。于100目铜网过滤，滤过物静置4 min。④取第二层脂肪细胞悬液100 μL于0.5 mL离心管中，加入100 μL 0.4%台盼蓝染液，吹打混匀，染色2～3 min。⑤吸取10 μL混合液滴入放好盖玻片的血细胞计数板上方凹槽处，于倒置显微镜下观察脂肪细胞。在倒置显微镜200×下随机选取3个计数方格，观察脂肪细胞并计数（活细胞拒染呈无色透明样，死细胞染成淡蓝色）取平均值。⑥脂肪细胞存活率=活细胞数/（死亡细胞数+活细胞数）×100%。

1.2.6 肌酸激酶测定比较脂肪细胞活力  ①取颗粒脂肪0.5 mL，加生理盐水1.5 mL，放入组织研磨器内，在冰水浴内进行组织研磨，破碎脂肪细胞。②研磨后的脂肪组织匀浆，离心5000 r/min，离心2 min，吸取离心后的中层液0.25 mL，加入0.25 mL生理盐水稀释。③将CK试剂盒中试剂一至试剂五按比例混合后37℃预温5 min，取20 μL待测样本加入300 μL混合试剂，混匀后37℃水浴20 min。④加入100 μL试剂六，混匀，3500 r/min离心10 min。⑤取离心后上清液300 μL，加入配置好的定磷液2000 μL。⑥37℃水浴下于2 min后吸取1000 μL于96孔板（每孔100 μL，每孔设3复孔）于酶标仪630 nm下测定OD值，比较各组酶活力大小。

1.2.7 HE染色  （1）冰冻切片的制备：①固定。向盛有脂肪组织标本的冻存管中加入PFA至最大刻度处，水平摇床震荡20 min。②脱水。吸出PFA，加入等体积15%蔗糖溶液，震荡2～3 h后换30%蔗糖溶液震荡12 h。③包埋。OCT包埋剂浸没包埋组织块，低温速冻。置于恒温冰冻切片机进行切片，于-80℃深低温冰箱中保存待用。（2）HE染色：①取冰冻切片，烤片后用PBS洗去包埋剂3 min×2次;②HE染色;③由低到高梯度酒精脱水;④双二甲苯固定;⑤中性树脂封片，于显微镜下观察并拍照;⑥按照是否存在完整有核脂肪细胞、囊腔和空泡，对细胞膜的破裂程度、网格连接连续性进行评估。

1.2.8 免疫组织化学染色  ①取冰冻切片，切片制备同HE染色。②3%H2O2去离子水孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性。③滴加SP试剂盒中A试剂室温孵育15 min，倾去试剂。④滴加CD105抗体，4℃过夜，PBS洗3 min×2次。⑤滴加试剂B，室温孵育15 min，PBS洗3 min×2次。⑥滴加试剂C，室温孵育15 min，PBS洗3 min×2次。⑦DAB显色剂显色室温10～20 min，显微镜下观察显色情况，显色充分后，自来水冲洗。⑧苏木精复染，梯度酒精脱水，双二甲苯固定。⑨中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪细胞存活率

台盼蓝染色后于倒置显微镜下观察，死亡脂肪细胞被染成蓝色，成活脂肪细胞不着色。。倒置显微镜计算各组脂肪细胞存活率，结果显示A、B两组脂肪细胞存活率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 肌酸激酶测定

标本复温后，通过CK试剂盒测定分析脂肪细胞活力，在反应2 min后于630 nm下行OD值测定，A、B组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 HE染色

HE染色下，正常脂肪细胞呈空泡状、网状连接，细胞膜染成紫红色、胞核呈深紫色，居于细胞一侧。A、B组标本冰冻切片后HE染色显微镜（200×）下观察比较脂肪细胞形态发现，A、B组脂肪细胞形态基本保持正常，胞膜连续完整，冻存后基本未受损伤。

2.4 免疫组织化学染色

各组标本经CD105染色后，仅于A组中找到少数脂肪干细胞（ADSCs）因切片位置的不确定性及数量过少不具备统计分析条件，故未做干细胞数量对比分析。

3 讨论

目前冷冻技术已应用到多个学科领域，有关组织冻存的温度选择，较常见的冻存温度是4℃（普通家用冰箱冷藏室）、-20℃（普通家用冰箱冷冻室）、-80℃（深低温冰箱）及-196℃（液氮）。-80℃（深低温冰箱）条件下可在相对较长时间保持较高组织活力，-196℃（液氮）环境下，组织和细胞内各种酶的活力及代谢近乎于零，即所谓“生命悬滞状态”，理论上，在液氮中组织和细胞可以无限期储存[24]。但临床实践中，冻存多长时间而不致细胞丧失活性，各研究报道不一。自体脂肪移植后再吸收较多出现在术后3～6个月，5个月后方可完全再生[23]。据此，本实验选择-196℃下分別冻存3个月及6个月的颗粒脂肪标本，通过台盼蓝染色计数脂肪细胞数量、CK测定脂肪细胞活力、HE染色观察脂肪细胞形态、免疫组化CD105染色计数脂肪干细胞数量比较脂肪细胞活力的变化。

Shoshani等[11]将抽吸获取的脂肪颗粒冻存于-18℃普通冰箱中保存2周后融化注入裸鼠体内，15周后测量移植物重量、体积及组织学检测，与新鲜脂肪组比较，差异无统计学意义，认为冷冻脂肪组织生存最关键的阶段是冻结和解冻的过程，而不是冻存时间的长短[11，25]。如果能够在冷冻降温、加热升温的过程中避免冰晶的产生，或虽有冰晶形成但未对细胞超微结构造成影响，即实现所谓的“玻璃化储存理论”，就能避免或减轻冷冻保存对细胞的损伤，较好地维持细胞的活力[26]。因此，我们在标本冻存过程中也尽量实现“玻璃化”储存，采用“两步法”，即“部分玻璃化”的方法，先采取一般速率进行降温，让细胞外溶液中产生冰，使细胞内水分外渗，胞内溶液浓度逐渐增高;第二步再以较快的速度进行降温，实现胞内溶液玻璃化。这样的操作可能对保持细胞活性具有积极作用。

本研究结果提示，台盼蓝染色显示两组脂肪细胞成活率无明显差异。CK检测两组酶活力基本一致。HE染色提示两组脂肪细胞形态基本保持正常，冻存后基本未受损伤。CD105实验中两组标本检出ADSCs数量均较少，不具备统计分析的条件，故未做两组间的差异性分析。

综上，经-196℃冻存的人体颗粒脂肪组织，至少在6个月内能够保持细胞的基本形态和活力，说明深低温冻存人颗粒脂肪组织安全有效。以后将进一步进行延长冻存时间的相关研究，为临床应用提供有力依据。

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（收稿日期：2018-08-17  本文编辑：金   虹）