一种基于刃天青还原的荧光方法对β-葡萄糖苷酶活性的检测

程 鑫，张 珩，马济美

(华中农业大学 理学院，湖北 武汉 430070)

β-葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于多糖或糖缀合物末端的非还原性β-D-葡萄糖苷键，释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶可以参与纤维素的代谢以及多种生理生化过程，并广泛存在于各种动植物和真菌体内[1-3]。因此，对β-葡萄糖苷酶的研究及应用在多个领域中被广泛开展，例如，在食品工业领域，β-葡萄糖苷酶被用来使蔬菜、水果、茶叶等食物产生增香作用[4]；在临床医学中，β-葡萄糖苷酶在疾病(如高氏病等)的诊断、治疗中发挥着重要作用[5-6]；日用化工业中利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷作用生产非离子表面活性剂烷基糖苷；β-葡萄糖苷酶在微生物、土壤、农业等领域也起着至关重要的作用[7-8]。

目前，β-葡萄糖苷酶的检测方法主要有分光光度比色法和荧光光谱法。比色法常以水杨苷或对硝基苯基-β-葡萄糖苷(pNPG)为底物，操作简便，但易受干扰。荧光法多使用4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)为底物[9]，通过测定酶解产生的4-甲基伞形酮的吸光度测定β-葡萄糖苷酶的活性[10];此法灵敏度较高，但体系pH值对4-甲基伞形酮的荧光有很大影响，而且其蓝色荧光易与生物样品的背景重叠，受其他酶干扰，故应用范围受到限制。因此，有必要开发简便高效的检测β-葡萄糖苷酶的方法。

刃天青(Resazurin)是一种蓝色染料，被广泛用作生物指示剂[11]。刃天青还原法广泛应用于食品和生物检测，包括食品中微生物含量的生化测试[12-13]，血糖的测定[14]，葡萄糖氧化酶[15]、碱性磷酸酶[16]和酪氨酸磷酸酶的检测，精液样品中代谢活性精子的浓度估算[17-18]，微生物生物膜活性的染色定量检测[19]，细胞在生物反应器中的活性测定[20]，十字花科植物种子的活性检测等[21-22]。

利用刃天青被还原后荧光增强的性质，本文开发了一种简单灵敏的荧光方法用于β-葡萄糖苷酶活性的检测。该法以2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)为底物，通过酶解生成抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)，将刃天青还原生成具有强烈荧光的试卤灵(Resorufin)，通过体系荧光强度变化检测β-葡萄糖苷酶的活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

带有氙灯的Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)；Agilent 1200高效液相色谱(美国安捷伦科技有限公司)；600 MHz Brucker核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。超纯水通过Millipore Milli-Q Academic仪器(德国默克密思博有限公司)纯化得到。

刃天青(树脂天青，纯度90%)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、一水合柠檬酸、抗坏血酸均购于阿拉丁试剂有限公司，β-葡萄糖苷酶(10 U)购自上海宝曼生物公司(中国)。2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)由本课题组根据文献[23]合成。其余试剂均购于国药集团或阿拉丁试剂有限公司，直接使用，溶剂在使用前均经干燥和纯化。

1.2 实验内容

1.2.1抗坏血酸还原刃天青实验用pH 7.5的20 mmol/L的磷酸盐缓冲液配制20 μmol/L的刃天青溶液和2.5 mmol/L的抗坏血酸溶液。取0.5 mL 20 μmol/L的刃天青溶液加入到1 mL 2.5 mmol/L的抗坏血酸溶液中，于37 ℃下反应，检测反应液在0、10、20、30、40、50、60 min时的紫外吸收光谱。

1.2.2抗坏血酸的检测取200 μL 20 μmol/L的刃天青溶液和1 mL不同浓度的抗坏血酸在55 ℃下反应120 min，检测反应液的荧光强度。

图1 酶诱导还原刃天青机理Fig.1 Reaction mechanism of enzymatic induced reduction of resazurin

1.2.3β-葡萄糖苷酶的检测用pH 5.0的10 mmol/L柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液配制10 mmol/L的AA-2βG溶液和不同浓度的β-葡萄糖苷酶溶液，取100 μL AA-2βG溶液和200 μL不同浓度的β-葡萄糖苷酶溶液在45 ℃下反应45 min后，加入30 μL 100 mmol/L的NaOH溶液调至pH 7.5，再加入用100 μL pH 7.5的磷酸盐缓冲液配制的20 μmol/L的刃天青溶液，55 ℃下反应1 h，检测反应溶液的荧光变化。

图2 不同条件下传感系统的荧光响应Fig.2 Fluorescence response of the sensing system at different conditionsa.20 mmol/L resazurin;b.a+500 U/L β-glucosidase; c.a+15 mmol/L AA-2βG;d.b+15 mmol/L AA-2βG; excitation wavelength:530 nm

图3 刃天青和抗坏血酸混合后的紫外光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra of resazurin incubating with ascorbic acid2.5 mmol/L ascorbic acid was mixed with 20 mmol/L resazurin in 20 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5),and the spectra were recorded each 10 min;inserts:photographs of the corresponding reaction mixtures in the process of the reaction under normal visible light

2 结果与讨论

2.1 检测机理

设计方法的检测机理如图 1所示，首先以合成的AA-2βG为底物，非还原性的AA-2βG在β-葡萄糖苷酶的水解作用下生成抗坏血酸。刃天青作为一种很好的氧化还原指示剂，可以响应体系中所产生的抗坏血酸，被抗坏血酸还原生成试卤灵，从而释放出强烈荧光。刃天青自身几乎没有荧光，底物AA-2βG和β-葡萄糖苷酶对其荧光强度基本没有影响(图2曲线a、b、c)，当刃天青与AA-2βG和β-葡萄糖苷酶混合后，体系产生的抗坏血酸将刃天青还原成试卤灵，在585 nm处产生强烈荧光(图2曲线d)，因此可以通过检测溶液的荧光强度实现β-葡萄糖苷酶的分析检测。

2.2 抗坏血酸还原刃天青实验

将刃天青和抗坏血酸混合，随着时间的延长，混合液在波长380 nm和600 nm处的紫外吸收强度逐渐降低，同时在571 nm处出现新的紫外吸收峰且强度逐渐增强(图3)。在此过程中，混合溶液的颜色从最开始的青蓝色变为紫红，最终变为粉红色。

2.3 抗坏血酸检测条件的优化

本实验中，β-葡萄糖苷酶检测的灵敏性直接取决于抗坏血酸检测的灵敏度。因此考察了缓冲液pH值、反应温度、反应时间对抗坏血酸和刃天青体系荧光强度的影响。结果显示，pH 7.5时体系荧光强度最大，在此条件下，当体系温度为55 ℃，反应时间为1 h时，抗坏血酸的检测效果最好。

在上述优化条件下，将20 μmol/L的刃天青溶液和不同浓度的抗坏血酸溶液反应，结果显示，抗坏血酸溶液的浓度在3～400 μmol/L范围内与反应体系在585 nm处的荧光强度呈现较好的线性关系，相关系数r2为0.981。

2.4 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

利用β-葡萄糖苷酶的水解活性，以AA-2βG为底物，测定其酶学特性。用pH 5.0的柠檬酸和磷酸氢二钠为反应缓冲液，配制500 U/L的β-葡萄糖苷酶溶液、300 mmol/L的AA-2βG溶液，分别于20、30、40、45、50、55、60 ℃下反应1 h。结果显示，AA-2βG在45 ℃下水解产率最高。在45 ℃下，考察了缓冲液pH值对β-葡萄糖苷酶(500 U/L)和AA-2βG(300 mmol/L)反应(1 h)的影响，发现pH 5.0时酶活性最高。在45 ℃、pH 5.0的条件下，每隔15 min检测AA-2βG水解的抗坏血酸的量，发现酶水解的适宜时间在45 min之内。因此，确定β-葡萄糖苷酶水解AA-2βG的最佳条件为：缓冲液pH 5.0，反应温度45 ℃，反应时间45 min。

2.5 β-葡萄糖苷酶的检测

10 mmol/L的AA-2βG溶液与不同溶度的β-葡萄糖苷酶溶液反应1 h后将体系pH值调至7.5，再加入刃天青继续反应，同时测量体系的荧光强度。结果显示，随着β-葡萄糖苷酶浓度的增加，585 nm处的荧光强度逐渐增强，溶液从青蓝色逐渐变成紫红色，随后变为粉红色。以溶液荧光强度为纵坐标，酶浓度为横坐标进行线性拟合，发现酶浓度在1～30 U/L范围内，与溶液荧光强度呈线性关系，线性方程为y=1.268 7x+37.636，相关系数r2=0.995，说明在此浓度范围内可对β-葡萄糖苷酶进行定量检测，根据IUPAC的定义计算，得出检出限为1.0 U/L。

3 结 论

本文基于刃天青的还原机理，建立了一种β-葡萄糖苷酶活性检测的新方法。以2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)为底物，使之通过酶催化水解反应生成抗坏血酸，后者将刃天青还原成具有强烈荧光的试卤灵，通过荧光变化检测β-葡萄糖苷酶的活性。该方法操作简单，检测灵敏度高，既可通过裸眼进行定性检测，也可实现定量检测，为β-葡萄糖苷酶的活性检测提供了新方法。