共价有机笼CC3-R毛细管电色谱柱用于拆分扁桃酸化合物的研究

2019-04-08田春容朱鹏静何宇雨袁黎明

分析测试学报 2019年3期

田春容，朱鹏静，吕云，何宇雨，字敏，袁黎明

(云南师范大学化学化工学院，云南昆明 650500)

手性分离一直都是学术界研究的热门课题之一，受到人们的高度关注，随着药物手性和药效关系的深入研究，人们越来越意识到手性药物的临床意义。含手性的临床用药超过50%，其中85%以上以外消旋体形式存在。扁桃酸是手性药物中广泛使用的化学中间体，可合成环扁桃酯(血管扩张剂)、扁桃酸苄酯(镇痉剂)以及乌洛托品(尿路消毒剂)等药物。因此研究扁桃酸的手性拆分对生物不对称合成及单一对映体的药理和药效具有重要意义[1]。

多孔有机分子笼(POC)是一种通过弱分子间作用力堆积自组装形成的具有永久性空腔的三维笼状有机分子，是多孔材料的一种，因具有比表面积高、骨架密度低、化学稳定性和热稳定性良好等特点，而在气体吸附与存储、分离、分子识别、传感、催化等领域有着潜在的应用价值和广阔的应用前景，近几年来迅速成为研究热点[2-3]。Cooper等[4]在Gawronski的基础上对合成的晶体进行了深入研究，不仅给出了单晶数据还报道了一系列类似亚胺的POC材料，这些POC材料均由1,3,5-均苯三甲醛或者1,3,5-三(4-苯甲酰基)苯或三(4-甲酰苯基)胺和一些二胺经过席夫碱环缩合反应而制成的笼型分子。POC材料在普通有机溶剂中具有良好的溶解性，且挥干溶剂后不会改变其本身结构和性质，非常适合用作毛细管色谱的固定相。2015年,本课题组申请的中国专利[5]首次证实了手性POC材料可用作气相色谱固定相，对分离手性化合物具有较高的选择性、较好的稳定性及重现性。随后，POC材料在气相色谱手性分离中的应用得到进一步发展，如CC3[6]、CC9[7]和CC10[8]等POC材料被开发出来用作气相色谱的固定相，其中，CC3晶体已被用于有机合金[9]、膜[10]、气体吸附[11]和毛细管电色谱[12]等研究领域。本文将CC3-R晶体用作毛细管电色谱手性固定相制备了开管毛细管柱，并以其对扁桃酸进行了拆分，分离度达1.81。表明手性CC3-R作为一种新型的毛细管电色谱手性固定相具有良好的应用前景。

1 实验部分

1.1 试剂、仪器与材料

1,3,5-均苯三甲酸、三氟乙酸(TFA)、氯铬酸吡啶鎓(PCC)、四氢化铝锂(LiAlH4)和(R,R)-1,2-环己二胺购于日本TCI公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于阿达玛斯试剂公司；盐酸、氢氧化钠、二氯甲烷和磷酸购于天津风船化学试剂公司；扁桃酸购于美国Sigma-Aldrich试剂公司。所用试剂均为分析纯及以上。弹性石英毛细管(75 μm内径)由锐沣色谱器件有限公司提供(河北永年公司)。HP-β-CD-Tris缓冲液：取0.12 mol/L HP-β-CD溶液加入异丙醇-100 mmol/L Tris溶液(体积比18 ∶ 82)中，再用磷酸调至pH 7.6。毛细管电色谱实验均在CL1020高效毛细管电泳仪(北京华阳利民仪器有限公司)上完成。

1.2 CC3-R晶体的合成

参照文献[13-14]合成CC3-R晶体。具体步骤：取20 mL二氯甲烷和20 μL三氟乙酸缓慢加入含有1.0 g 1,3,5-均苯三甲醛的圆底烧瓶中，静置5 min，加入20 mL溶有1.0 g (R,R)-1,2-环己二胺的二氯甲烷溶液，室温下密封反应72 h，待烧瓶内壁有晶体生成后用G4 60 mL砂芯漏斗过滤，再用乙醇-二氯甲烷(体积比95 ∶ 5)洗涤，最后于50 ℃下干燥得1.2 g CC3-R固体产物，产率约为32%。

1.3 毛细管预处理

毛细管使用前，需进行内壁粗糙化处理：取内径为75 μm的弹性石英毛细管先用1 mol·L-1NaOH溶液冲洗2 h，再用蒸馏水冲洗0.5 h，接着用0.1 mol·L-1的HCl溶液冲洗1 h，中和残留的NaOH，再用去离子水冲洗至中性，最后连接在气相色谱仪上用N2于110 ℃下吹干备用[15]。

1.4 CC3-R毛细管柱的制备

本实验所用毛细管柱采用静态涂敷制作：将CC3-R溶于CH2Cl2中配成5 mg·mL-1的溶液，超声脱气，再将上述溶液抽入毛细管柱中，待其充满整根毛细管柱后密封住其中一端，将另一端与真空瓶连接，使二氯甲烷在36 ℃水浴条件下挥干，此时，CC3-R已涂敷在毛细管的内壁表面，然后对柱子进行老化处理，即得CC3-R色谱柱[16]。

1.5 毛细管电色谱条件

取一根制备好的长为55 cm(内径为75 μm)的CC3-R毛细管柱，在距离末端8 cm处烧掉大约5 mm的毛细管外壁涂层，用以制作检测窗口，毛细管的有效长度(从进样端口至检测窗口处)为45 cm，放入高效毛细管电泳仪内。涂覆的开管柱在首次使用前均预先用去离子水和HP-β-CD-Tris缓冲液液(使用前需超声脱气处理)分别冲洗10 min，直至运行获得稳定的基线。实验中以硫脲为电渗流标记物[17]。所有毛细管柱在每次连续进样之间均需用去离子水和HP-β-CD-Tris冲洗3 min。本实验所有操作均在室温下进行，进样方式为虹吸进样，进样高差约为10 cm，进样时间为10 s，紫外检测波长为254 nm。

实验结果中的分离因子a=t2/t1，分离度Rs=1.18(t2-t1)/(W1/2(1)+W1/2(2))，理论塔板数N=5.54(tR/W1/2)2/L；其中t1和t2分别为2个对映体的迁移时间(min)，W1/2(1)和W1/2(2)分别为两个对映体的半峰宽(min)，L为色谱柱的有效长度(m)，tR为对映体的迁移时间(min)，W1/2为对映体的半峰宽(min)[18]。

图1 CC3-R晶体粉末的XRD衍射图Fig.1 XRD diffraction patterns of CC3-R crystal powdera.simulated；b.the XRD diagram synthesized by experiment；c.the XRD diagram immersed in HP-β-CD-Tris buffe solution for 24 h

2 结果与讨论

2.1 CC3-R晶体的表征

CC3-R晶体粉末的XRD衍射图见图1，由图可见，实验制得的晶体XRD图(曲线b)与文献晶体数据模拟的XRD(曲线a)[13]能够非常好地吻合在一起，表明实验所合成的CC3-R晶体与文献一致。将制备的CC3-R晶体在HP-β-CD-Tris缓冲溶液中浸泡24 h，挥干溶剂后重新析出晶体，再进行XRD测试(曲线c)，发现衍射峰位置与浸泡前完全一致，表明CC3-R晶体在HP-β-CD-Tris缓冲液中稳定性良好，可进行下一步电色谱实验。

对CC3-R晶体进行热重分析考察其热稳定性，发现300 ℃以内该化合物能够稳定存在，不会发生分解或改变，因此制柱的老化处理过程不会对CC3-R晶体的结构产生影响。

2.2 CC3-R涂覆毛细管柱电镜图

实验考察了毛细管内壁中CC3-R晶体的涂覆情况，将涂好的毛细管柱截取大约0.5 cm，进行SEM分析(图2)。由图可见，CC3-R已成功涂覆在毛细管内壁上，膜厚大约为80 nm，且涂覆效果良好。

2.3 CC3-R涂覆毛细管柱电渗流的表征

对实验制备的CC3-R涂覆毛细管柱进行了性能测评，考察了电压对电流值的影响。结果显示，当电压以2 kV为单位梯度由8 kV增至20 kV时，电流随电压线性增大，相关系数为0.995 8，表明该毛细管柱在此条件下的柱内焦耳热效应较小，可在大范围内选择分离电压。

实验还比较了pH值(3.5～8.5)对空白毛细管柱和CC3-R涂覆毛细管柱的影响，结果显示，2种毛细管中的电渗流均随pH值的增大而增大，变化趋势相似，但空白柱的电渗流明显大于CC3-R柱，可能是由于当pH值大于3.0时，空白柱毛细管石英内壁的硅羟基开始解离,且解离程度随着pH值的增大也越来越大，从而导致电渗流逐渐增大。而涂覆过的开管柱则因表面覆盖了CC3-R，电渗流的增大不如空白柱，进一步表明CC3-R晶体已经成功地涂覆在毛细管内壁，同时也说明该晶体自身不产生或仅产生微小的电渗流。

图3 扁桃酸在涂覆柱上的分离电色谱图Fig.3 Separation of mandelic acid on coated column HP-β-CD-Tris buffer solution(pH 7.6)；separation voltage：15 kV；sample injection：10 cm height difference 15 s；UV detection wavelength：254 nm

2.4 CC3-R涂覆毛细管柱对扁桃酸的拆分

实验考察了CC3-R涂覆毛细管柱对手性化合物的拆分能力，选择在HP-β-CD-Tris缓冲液中对扁桃酸进行手性拆分。结果显示,D-扁桃酸和L-扁桃酸在CC3-R涂覆柱得到良好的基线分离，分离度为1.81，理论塔板数分别为36 700 N/m和41 600 N/m，色谱谱图见图3。

色谱手性分离研究中，由于固定相微观环境对手性识别影响十分复杂，且多孔有机笼在手性电色谱分离研究中尚处于起步阶段，对其在色谱手性分离中的研究报道也较少，因此难以确定多孔有机笼在毛细管开管柱中的手性识别机理。本实验合成的CC3-R是一种具有类似四面体构型的笼状分子，每一个笼分子都具有手性，笼的中央具有一个空腔，空腔周围有4个类似三角形的孔窗口，相邻的笼分子之间通过窗-对-窗的方式堆积自组装形成一种多孔分子晶体，且形成的通道与每个孔窗口相互贯通(图4)。此时分析物与CC3-R中手性通道及分子内空腔之间的主-客体包合和立体构型匹配作用可能会对手性分离产生至关重要的作用[12]。据此推测，手性识别的效果很可能与此晶体特殊的微观结构相关。除此之外，流动相和固定相中各分子间作用力也会对手性分离起到一定作用。

图5 不同长度CC3-R涂敷毛细管对扁桃酸的分离谱图Fig.5 Separation of mandelic acid by capillary coated with CC3-R with different lengthsa.65 cm,b.55 cm,c.45 cm

2.5 重现性及稳定性评价

稳定性和重现性是评价毛细管电色谱的重要指标，为测试CC3-R涂覆毛细管柱的稳定性和重现性，在HP-β-CD-Tris缓冲液中，于15 kV运行电压下，连续进样5次扁桃酸，计算得其保留时间的相对标准偏差(RSD)为1.2%；另取3根长度分别为45、55、65 cm的CC3-R涂敷毛细管柱考察对扁桃酸的分离情况，发现均能实现扁桃酸的基线分离，分离度分别为1.90、1.81、1.72，但出峰时间不同(图5)。