基于氢核磁共振技术和化学计量学方法鉴别蜂蜜品种

宋晓莹，陈兰珍,2,3*，李 熠,2,3，周金慧,2,3，陈 雷，辛曼曼

(1.中国农业科学院 蜜蜂研究所，北京 100093；2.农业农村部 蜂产品质量安全控制重点实验室，北京 100093；3.农业农村部 蜂产品质量安全风险评估实验室,北京 100093；4.中国科学院武汉物理与数学研究所，湖北 武汉 430071)

蜂蜜的物质组成复杂，其主要成分是糖类，占蜂蜜成分的65%～80%，糖类中又以葡萄糖和果糖为主。此外，还有18%～22%的水，少量的蛋白质、酶、游离氨基酸、黄酮类物质、酚酸类物质、矿物元素以及微量元素[1]。常见的蜂蜜品种是按照蜜蜂所采集的蜜源植物不同进行划分。我国地域辽阔，蜜源植物种类较多，能得到的商品蜜种类多达几十种。因此，还衍生出其他划分蜂蜜品种的方式，如根据蜂蜜的颜色可划分为浅色蜜和深色蜜，市面上常见的洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴树蜜为浅色蜜，枣花蜜、荞麦蜜为深色蜜。

蜂蜜作为一种药食同源的食品，近年来的市场需求量不断增加。由于不同蜜源植物来源的蜂蜜品质及感官特征不同[2]，因此在市场中，不同品种蜂蜜的价格差异较大，且以浅色蜜更受欢迎[3]。但不同种蜂蜜的主要成分含量差别很小，传统方法很难鉴别蜂蜜品种，因此出现了低价蜜掺入高价蜜中进行销售的现象，造成蜂蜜品种标识混淆，市场价格混乱[4]，并已成为蜂蜜市场中一个比较突出的问题。

蜂蜜品种的传统检测方法是感官鉴别和花粉分析，其结果判断带有一定的主观性，需要实验员具有丰富的经验和专业的知识背景[5-6]。近年，一些检测技术也被应用于蜂蜜品种鉴别中，主要包括高效液相色谱[7]、液相色谱-质谱联用技术[8]、气相色谱-质谱联用技术[9]、光谱技术(如近红外光谱、中红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱)[10-13]、电感耦合等离子体质谱[14]等。这些方法均有各自的优缺点，尚未有一种检测技术能够有效地鉴别不同品种的蜂蜜。

氢核磁共振技术(1H NMR)是依靠核磁共振现象测定分子结构的一种谱学技术，通过对样本施加外加磁场，使处在低能态的自旋核发生跃迁到高能态，当自旋核发生弛豫返回低能态时，产生核磁共振信号[15]。该技术一次进样就可检出样品中所有含氢的化合物，检测物质的覆盖面广，样本预处理简单，上机分析所需时间较短。近年来，1H NMR被广泛应用到食品领域，并在牛奶[16]、橄榄油[17]、酒类[18]的品种鉴别以及咖啡[19]、牛奶[20]的产地识别中取得了很好的成果。现阶段，该方法在蜂蜜品种鉴别领域中的应用较少。本研究采用1H NMR对洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜进行全谱图分析，结合化学计量学的方法，以期从整体物质角度，建立最佳的判别分析模型，从而为解决蜂蜜品种的鉴别提供行之有效的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AVANCE 600MHz液体NMR仪(瑞士 Bruker 公司)；PL103电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)：移液枪(德国 Eppendorf 公司)；1-15PK台式高速离心机(德国 Sigma 公司)；5 mm 核磁管(美国 Norell 公司)；涡旋混合器(美国 Scientific Industries 公司)。

三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)、二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)购自上海国药集团试剂有限公司；重水(D2O，99.9%氘代，含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸(TSP)，美国 Cambridge Isotope Laboratories公司)。

1.2 样品信息

实验选择的蜂蜜品种为洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜，均为较受市场欢迎的浅色蜜。所有的蜂蜜样品均直接取自蜂场中自然酿造的成熟蜜。共收集144个样品，在4 ℃的冰箱中贮藏、备用。蜂蜜样本的具体信息如表1所示。

表1 蜂蜜样本的信息Table 1 The information of honey samples

1.3 NMR样品的制备

将蜂蜜从冰箱中取出，放置至室温。对有结晶的样品，在60 ℃水浴加热，待样品完全溶解后再称样。称取蜂蜜100.00 mg置于离心管中，加入1.2 mL pH 7.4的磷酸缓冲液(0.15 mol/L K2HPO4/ NaH2PO4,使用含10% D2O 的双蒸水配制而成)后，在涡旋振荡器上振荡5 min，直至样品混合均匀。在8 000 r/min下离心10 min,取600 μL上清液转至5 mm 核磁管中。

1.4 数据采集与处理

在600 MHz液体NMR仪上，采用NOESYPR1D脉冲序列(Recycle delay-90°-t1-90°-tm-90°-acquisition)采集样品信息，序列中90°脉冲的脉宽为14.5 μs，固定间隔t1为4 μs，混合时间tm为2.27 s，实验温度设置为298 K。采用预饱和方法进行水峰抑制，持续2.0 s。1H NMR的谱宽设为 12 000 Hz，采样点数为32 768，信号累加次数为64次。所有得到的自由感应衰减信号经过指数加权和傅里叶变化(指数线宽因子为0.3 Hz)后得到核磁共振的一维图谱。

对得到的1H NMR谱图进行处理，手动调节基线、相位，对化学位移定标,将内标TSP的共振峰设为δ0.00。将处理好的NMR谱图按照每段宽度为δ0.004进行分段积分，为消除残留水信号的影响，剔除δ4.73～4.93区间的信号。为减少不同组分和样品间的差异，对信号峰的峰面积进行归一化处理，所得到的积分数据导入Excel文件中保存。采用SIMCA 13.0 软件(v13.0,Umetrics.,Sweden)进行数据分析。

图1 洋槐蜜(A)、油菜蜜(R)、荔枝蜜(L)的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectra of acacia honey(A),rape honey(R) and lychee honey(L)1.formic acid(甲酸),2.phenylalanine(苯丙氨酸), 3.tyrosine(酪氨酸),4.kojibiose(曲二糖), 5.sucrose(蔗糖),6.nigerose(黑曲霉糖), 7.turanose(松二糖),8.α-glucose(α-葡萄糖),9.citric acid(柠檬酸),10.succinic acid(琥珀酸),11.proline(脯氨酸), 12.acetic acid(乙酸),13.alanine(丙氨酸),14.lactic acid(乳酸), 15.3-hydroxy-butanone(3-羟基丁酮),16.ethyl acetate(乙酸乙酯), 17.ethanol(乙醇),18.2,3-bu-tandiol(2,3-丁二醇), 19.valine(缬氨酸)

2 结果与讨论

2.1 谱图解析

选取洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜的核磁谱图进行对比，发现不同品种蜂蜜的谱图无明显差异。蜂蜜的1H NMR 谱图可以分为3部分：脂肪区(δ0.0～3.0)，糖类化合物区(δ3.0～6.0)，芳香区(δ6.0～9.5)。通过局部放大3个区域的主要信号峰区间(图1)，对其中的信号峰进行鉴别，并结合化学位移、耦合常数、峰形等信息，查阅相关参考文献对信号峰进行归属后，共鉴定出19种化合物[21-23]。

在脂肪区主要集中有机酸、氨基酸以及醇类物质的信号峰。在糖类化合物区域，有效信号主要集中在δ5.0～5.5，集中着单糖和二糖信号。在芳香区中，可鉴别出苯丙氨酸、酪氨酸、甲酸3种物质中苯环上氢质子的共振信号。

2.2 数据分析

在蜂蜜中,葡萄糖、果糖等单糖含量较高，与丙氨酸等含量低的物质在含量上可以相差数个数量级，因此在后续进行多变量统计分析时，信号较弱的成分含量变化会被信号较强的成分含量变化所掩盖，进而影响差异成分的识别。为了避免上述情况出现，在建模前需对数据进行优化。常见的数据预处理方法包括：中心化(Mean center scaling,Ctr)、自标度化(Unit variance scaling,UV)、帕莱托标准化(Pareto scaling,Par)。Ctr 处理是将数据集中的各项数据减去其均值，既不会改变样本点之间的相对位置，也不会促使变量间相关性发生改变，能够更好地分析数据集中波动的部分，但可能导致低含量的变量信息受到高含量变量信息的抑制[24]。UV处理可使新得到的每个变量的均值或标准差在同一个等级上，但噪声信号区域可能会影响最终结果[25]。在Par处理中，中心化和尺度变化同时进行,通过对每个变量赋予相同的缩放系数，可有效地减少较大信号数据的相对重要性，保留原始数据集结构的完整性，但变化相对较小的重要变量无法被选定为标记物[26]。因此，3种方法各有优缺点，在实际分析中需根据具体的数据进行筛选。

在SMICA软件中，常见的评价模型质量的参数有R2X、R2Y和Q2，其中R2X、R2Y分别代表模型对数据矩阵的解释能力，Q2代表模型整体的预测能力。通常情况下，R2和Q2值越接近1，则说明模越稳定可靠，该值大于0.5就证明模型的判别效果较好。

表2 PLS-DA模型在不同数据预处理下的模型参数Table 2 Model parameters of PLS-DA model under different data scaling methods

图2 PLS-DA在UV预处理下的得分散点图Fig.2 Score scatter plot of PLS-DA with UV scaling

MethodR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)Ctr0.7690.5260.471UV0.6320.9580.905Par0.6850.6940.607

图3 OPLS-DA在UV预处理下的得分散点图Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA with UV scaling

2.2.1偏最小二乘判别分析偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是一种常见的有监督的模式识别方法，是在主成分分析的基础上增加了一个隐形变量(Y)，使自变量向Y回归的程度达到最大，以此弱化组内之间的差异，突出组间的差异[27]。

分别在3种预处理条件下建立PLS-DA模型，3个模型中的参数见表2。通过参数对比，发现在UV模式下模型的判别效果最好。在此条件下建立PLS-DA模型，该模型中前8个主成分的累积贡献率R2Y已近95%，超过一般要求的累积贡献率(85%)。根据模型的得分散点图(图2)可看出，荔枝蜜样本主要集中在PC1得分值的负值区域，而洋槐蜜、油菜蜜样本主要集中在PC1得分值的正值区域；油菜蜜样本主要集中在PC2得分值的正值区域，洋槐蜜样本主要集中在PC2得分值的负值区域。3种蜂蜜之间有着明显的分离趋势，但仍然存在过重合的现象，需选择更为合适的判别模型。

2.2.2正交偏最小二乘判别分析为了进一步去除不相关的差异，更好地进行判别分离，在PLS-DA 基础上结合正交信号，去除与Y矩阵无关的X矩阵的变化，使得X矩阵和Y矩阵之间的关系最大化，将分组差异最大化[28]。因此，采用正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA法)进一步分析、比较不同品种蜂蜜之间的差异。

分别在3种预处理条件下建立OPLS-DA模型，通过对比同模型的特征参数值(表3)，发现在UV模式下，模型的R2Y和Q2值均最高，因此选择UV作为建模时的数据预处理方式。根据OPLS-DA模型得分图(图3)，发现在第二主成分下，3种蜂蜜可以得到很好的判别分离，油菜蜜主要集中在PC2得分值的正值区域，荔枝蜜处在坐标的中心区域，而洋槐蜜主要分布在PC2得分值的负值区域。

利用OPLS-DA模型可以有效地区分洋槐蜜、油菜蜜和荔枝蜜，所建模型对3种蜂蜜的判别解释能力达95.8%，对未知样本的预测能力为90.5%。

3 结 论

本文采用1H NMR结合化学计量学的方法进行蜂蜜品种的鉴别。通过对不同品种蜂蜜的主要核磁信号峰进行归属，共鉴定出19种化合物的特征峰。为了更好地挖掘核磁数据中的信息，讨论了在建立判别模型中数据预处理的方法，通过比较发现自标度化为最适合核磁数据建模的数据预处理方式。通过不断筛选合适的数据分析模型，发现在自标度化处理下，利用OPLS-DA模型可以很好地区分洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜。本文所采用的1H NMR是基于蜂蜜的全组分分析方法，能够获得样品的全部有效信息，有效弥补了其他检测技术对检出物质化学键、官能团的限制。将1H NMR与OPLS-DA相结合，能够快速、准确地区分不同品种的蜂蜜，从而为规范蜂蜜市场提供了一种新方法。